За передачей устойчивости к антибиотику у бактерий проследили в реальном времени
Ученые проследили при помощи прижизненной микроскопии за процессом передачи гена устойчивости к тетрациклину между клетками кишечной палочки и выяснили, как у клеток-реципиентов формируется устойчивость даже в присутствии антибиотика. Оказалось, что в этом процессе участвует мультисубстратная неспецифическая помпа AcrAB-TolC, которая может с низкой эффективностью выбрасывать из клетки широкий спектр антибиотиков, сообщается в статье в Science.
Быстрое формирование устойчивости к антибиотикам у бактерий происходит благодаря существованию механизмов горизонтального переноса ДНК, в частности, конъюгации, которая позволяет клеткам делиться друг с другом генами устойчивости (подробнее об этих механизмах можно прочитать в нашем материале «Поверх барьеров»). Исследователи из университета Лиона создали систему, основанную на использовании флуоресцентных белков, позволяющую в реальном времени наблюдать за передачей ДНК между клетками кишечной палочки.
В эксперименте ученые следили за передачей F-плазмиды — большого внехромосомного элемента, содержащего ген устойчивости к тетрациклину, — путем конъюгации. Для того, чтобы визуализировать процесс передачи плазмиды, авторы статьи пометили в реципиентных клетках зеленым флуоресцентным белком белок ParB, который специфически связывается с плазмидной двухцепочечной ДНК. В отсутствии F-плазмиды белок рассеян по всей клетке и создает равномерный зеленый фон, а при появлении в клетке реципиента одноцепочечной копии плазмиды и ее достройке связывается с плазмидой и образует в клетке зеленые фокусы. Транспортер TetA, который обеспечивает устойчивость к тетрациклину, в донорных клетках пометили красным флуоресцентным белком. После передачи плазмиды реципиенту он начинает синтезироваться и делает реципиента красным и устойчивым к антибиотику за счет интенсивного выкачивания его из клетки.
Наблюдение за процессом конъюгации позволило авторам статьи подсчитать, что конъюгация занимает около двух минут, а полный процесс копирования информации происходит в пределах десяти минут. Примерно через час после попадания донорных клеток в популяцию реципиентов треть популяции приобретает F-плазмиду. Синтез TetA начинается немедленно после попадания ДНК в клетку, причем даже в присутствии в среде тетрациклина в концентрациях, подавляющих деление.
Этот факт удивил исследователей, так как тетрациклин работает, подавляя синтез белка. Первая гипотеза, объясняющая феномен, состояла в том, что несколько молекул TetA попадает в клетку вместе с плазмидой и обеспечивает немедленную устойчивость, однако ее опровергли. Оказалось, что синтез белка в клетке в присутствии антибиотика происходит благодаря активности мультисубстратной помпы AcrAB-TolC, которая выкачивает часть молекул тетрациклина из клетки и поддерживает концентрацию, которая все еще подавляет деление клетки, но уже позволяет обеспечить синтез специализированного транспортера TetA. Когда гены, кодирующие помпу, удаляли из генома, бактерии теряли способность синтезировать транспортер в присутствии тетрациклина и становиться устойчивыми к антибиотику прямо на среде с антибиотиком.
Устойчивость возбудителей инфекций к антибиотикам представляет глобальную угрозу здравоохранению. Так, недавно мы рассказывали о смерти женщины, которую не смогли вылечить ни одним из существующих антибиотиков. Подробнее об этой проблеме можно прочитать в нашем материале «Конец прекрасной эпохи».
Дарья Спасская
Это облегчило симптомы поражения мышц и нервов
Выращивание дрозофил с дефектом первого комплекса дыхательной цепи в среде с комбинацией 5-аминолевулиновой кислоты, гидрохлорида и железа натрия цитрата (5-ALA-HCl + SFC) увеличивает выработку АТФ за счет повышения активности второго и четвертого дыхательных комплексов. Активность первого комплекса при этом не меняется. Кроме того, у дрозофил снижалось накопление лактата и пирувата, которое происходит при дефекте первого комплекса, что, по-видимому, облегчало симптомы поражения мышц и нервов. Исследование опубликовано в Human Molecular Genetics. В митохондриях происходит окислительное фосфорилирование — многоэтапный процесс, в ходе которого окисляются восстановительные эквиваленты — восстановленные никотинамидадениндинуклеотид (НАДН) и флавинадениндинуклеотид (ФАДН2), — и вырабатывается АТФ. Происходит последовательный перенос электронов по дыхательной цепи — группе дыхательных ферментов в мембране митохондрии. Всего в цепи участвует пять комплексов дыхательных ферментов. Нарушение переноса электронов по дыхательной цепи сопровождается снижением выработки АТФ и вызывает митохондриальные заболевания. Наиболее часто «ломается» первый комплекс — НАДН-КоQ-оксидоредуктаза, или НАДН-дегидрогеназа. Его дефицит поражает органы и ткани с высокими энергетическими потребностями, таких как мозг, сердце, печень и скелетные мышцы. Обычно это проявляется тяжелыми неврологическими синдромами: например, наследственная оптическая нейропатия Лебера, синдром MELAS или синдром MERRF. Хотя первый комплекс отвечает за поступление наибольшего количества электронов в дыхательную цепь, второй комплекс — ФАД-зависимые дегидрогеназы, — работая параллельно с первым, также отвечает за вход электронов в цепь, передавая их, как и первый комплекс на убихинон (коэнзим Q). Потенциально повышение активности второго комплекса могло бы нивелировать снижение активности первого. Поскольку второй, третий и четвертый дыхательные комплексы и цитохром с содержат гемовые структуры, команда ученых под руководством Канаэ Андо (Kanae Ando) из Токийского столичного университета решили проверить, насколько эффективно будет применение предшественника гема 5-аминолевулиновой кислоты для повышения активности этих комплексов и восстановления синтеза АТФ у дрозофил с дефектом первого комплекса. Сначала ученые отключили у дрозофил ген, гомологичный NDUFAF6 и ответственный за экспрессию одного из регуляторных белков первого комплекса. У таких дрозофил мышцы были тоньше, хрупче и иннервировались хуже, чем у насекомых без нокдауна гена. Кроме того, самцы с неработающим геном погибали намного быстрее самок, и у них развивались более грубые нарушения опорно-двигательного аппарата. Затем ученые проанализировали как нокдаун гена первого комплекса влияет на экспрессию и активность других комплексов. Выяснилось, что нокдаун увеличивает экспрессию генов третьего и пятого комплексов, и снижает — четвертого. При этом активность второго и четвертого комплекса значительно повышалась после нокдауна у самок дрозофил. Ученые не обнаружили нарушений в процессах утилизации активных форм кислорода, однако у дрозофил обоих полов без работающего гена первого комплекса накапливался лактат и пируват. Чтобы проверить влияние комплекса 5-аминолевулиновой кислоты, гидрохлорида и железа натрия цитрата (5-ALA-HCl + SFC) на митохондрии дрозофил с нокаутированным геном, их выращивали в среде, содержащей этот комплекс. Такое воздействие значительно повышало уровни АТФ у самцов и самок дрозофил, при этом количество копий митохондриальной ДНК не изменялось, то есть препарат не увеличивал количество митохондрий. Экспрессия и активность дефектного первого комплекса никак не изменились, а активность второго и четвертого комплексов выросли у самцов. В целом, повышенная экспрессия генов третьего комплекса и активность второго и четвертого комплексов смягчали дефектные фенотипы. Помимо этого 5-ALA-HCl + SFC снижало накопление лактата и пирувата у самцов и самок с нокдауном гена первого комплекса, что потенциально смягчает метаболические нарушения, вызванные дефицитом первого комплекса. У самцов и самок мух-дрозофил, которых лечили 5-ALA-HCl + SFC, наблюдалось меньше дефектов опорно-двигательного аппарата, а продолжительность их жизни значительно увеличилась. Ученые рассчитывают проверить эффект такого лечения на животных с более сложным строением, чтобы подтвердить универсальность такого подхода к лечению митохондриальных нарушений. Не всегда нужна мутация, чтобы нарушить работу дыхательной цепи. Недавно мы рассказывали про то, что большое количество натрия из потребляемой соли нарушает дыхательную цепь митохондрий в регуляторных Т-лимфоцитах. Это приводит к активации аутоиммунных процессов.