as

РНК-шпилька увеличила точность CRISPR в 50 раз

Загрузка галереи

Американские исследователи показали, что добавление небольшого элемента вторичной структуры к направляющей РНК может существенно увеличить точность редактирования ДНК CRISPR-системами. Как поясняют ученые в статье в Nature Biotechnology, РНК-шпилька мешает нуклеазной активности Cas-белка на «неправильных» мишенях, но не мешает в случае точного соответствия последовательностей между направляющей РНК и мишенью.

Т-Банк // CTF

Несмотря на значительный прорыв в области терапевтического применения CRISPR-редактирования (эти системы уже применяют для ex vivo редактирования генома отдельных клеток, например, лейкоцитов, и даже редактирования эмбрионов человека), ученых по-прежнему беспокоит точность работы CRISPR, которая нередко проявляет нецелевую активность в человеческом геноме. Увеличить точность узнавания и разрезания ДНК чаще всего пытаются путем внесения мутаций в CRISPR-эффекторы, в частности, белок Cas9. Тем не менее, такой подход, хоть и привел к созданию множества вариантов Cas с увеличенной специфичностью, чаще всего приводит и к существенному снижению эффективности редактирования на нужных мишенях.

Ученые из университета Дьюка подошли к проблеме с другой стороны и занялись настройкой РНК-компонента CRISPR. «Упрощенный» вариант CRISPR-системы, который используют в качестве инструмента редактирования в эукариотических клетках, включает эффектор (Cas9 или Cas12а) и направляющую РНК, которая содержит 20-нуклеотидный спейсер — участок, комплементарный последовательности в геноме, которую нужно порезать. Известно, что в точность узнавания основной вклад вносит первая часть спейсера. Исследователи предположили, что если оставшийся конец спрятать внутри вторичной структуры, точность редактирования увеличится.

Загрузка галереи

Чтобы проверить гипотезу, авторы работы предсказали in silico и показали экспериментально, что добавление короткой последовательности, образующей с 5’-концом РНК-спейсера небольшую и не очень прочную шпильку, не снижает эффективности связывания Cas9 с мишенью, но при этом влияет на эффективность редактирования. Последний параметр проверяли на направляющих РНК против генов VEGFA и EMX1, у которых есть по несколько известных «оф-таргетов» (участков неспецифического связывания в геноме).

Оказалось, что для таких участков шпилька значительно снижает нежелательную активность — как по сравнению с контрольным немодифицированным спейсером, так и по сравнению с укороченным вариантом спейсера, где лишние буквы просто отрезали, и по сравнению со спейсером с довеском, не образующим шпильки. На нужном участке активность CRISPR при этом существенно не менялась (хотя вычисления предсказывали ее снижение). В среднем для ряда оф-таргетов увеличение точности «канонического» SpCas9 из Streptococcus pyogenes произошло в 55 раз. Увеличение точности в присутствии шпильки авторы также увидели для других используемых на практике эффекторов — SaCas9 из Staphylococcus aureus и разных форм Cas12a.

Загрузка галереи

Обсуждая механизм наблюдаемого феномена, авторы работы предположили, что шпилька на конце спейсера ингибирует формирование комплекса РНК-ДНК (так называемой R-петли), которое необходимо для нуклеазной активности Cas-белка, в случае неточного спаривания ДНК-РНК, и таким образом, предохраняет систему от нецелевой активности. Самое главное в таком способе увеличения специфичности — его универсальность, так как направляющая РНК используется всеми CRISPR-системами, и ее просто синтезировать.

Посмотреть своими глазами, как работает CRISPR-Cas9 в клетке, можно

.

Дарья Спасская

Нашли опечатку? Выделите фрагмент и нажмите Ctrl+Enter.
Мыши с ГМ-клетками послушали группу Queen и выработали инсулин

Эффективнее всего себя показала композиция «We Will Rock You»