РНК-шпилька увеличила точность CRISPR в 50 раз
Charles Gersbach / Duke University
Американские исследователи показали, что добавление небольшого элемента вторичной структуры к направляющей РНК может существенно увеличить точность редактирования ДНК CRISPR-системами. Как поясняют ученые в статье в Nature Biotechnology, РНК-шпилька мешает нуклеазной активности Cas-белка на «неправильных» мишенях, но не мешает в случае точного соответствия последовательностей между направляющей РНК и мишенью.
Несмотря на значительный прорыв в области терапевтического применения CRISPR-редактирования (эти системы уже применяют для ex vivo редактирования генома отдельных клеток, например, лейкоцитов, и даже редактирования эмбрионов человека), ученых по-прежнему беспокоит точность работы CRISPR, которая нередко проявляет нецелевую активность в человеческом геноме. Увеличить точность узнавания и разрезания ДНК чаще всего пытаются путем внесения мутаций в CRISPR-эффекторы, в частности, белок Cas9. Тем не менее, такой подход, хоть и привел к созданию множества вариантов Cas с увеличенной специфичностью, чаще всего приводит и к существенному снижению эффективности редактирования на нужных мишенях.
Ученые из университета Дьюка подошли к проблеме с другой стороны и занялись настройкой РНК-компонента CRISPR. «Упрощенный» вариант CRISPR-системы, который используют в качестве инструмента редактирования в эукариотических клетках, включает эффектор (Cas9 или Cas12а) и направляющую РНК, которая содержит 20-нуклеотидный спейсер — участок, комплементарный последовательности в геноме, которую нужно порезать. Известно, что в точность узнавания основной вклад вносит первая часть спейсера. Исследователи предположили, что если оставшийся конец спрятать внутри вторичной структуры, точность редактирования увеличится.
Схема образования шпильки на 5'-конце РНК-спейсера
D. Dewran Kocak et al / Nature Biotechnology 2019
Чтобы проверить гипотезу, авторы работы предсказали in silico и показали экспериментально, что добавление короткой последовательности, образующей с 5’-концом РНК-спейсера небольшую и не очень прочную шпильку, не снижает эффективности связывания Cas9 с мишенью, но при этом влияет на эффективность редактирования. Последний параметр проверяли на направляющих РНК против генов VEGFA и EMX1, у которых есть по несколько известных «оф-таргетов» (участков неспецифического связывания в геноме).
Оказалось, что для таких участков шпилька значительно снижает нежелательную активность — как по сравнению с контрольным немодифицированным спейсером, так и по сравнению с укороченным вариантом спейсера, где лишние буквы просто отрезали, и по сравнению со спейсером с довеском, не образующим шпильки. На нужном участке активность CRISPR при этом существенно не менялась (хотя вычисления предсказывали ее снижение). В среднем для ряда оф-таргетов увеличение точности «канонического» SpCas9 из Streptococcus pyogenes произошло в 55 раз. Увеличение точности в присутствии шпильки авторы также увидели для других используемых на практике эффекторов — SaCas9 из Staphylococcus aureus и разных форм Cas12a.
Эффективность разных направляющих РНК на целевом локусе в гене EMX1 (ON) и нескольких нецелевых локусах (OT). WT-немодифицированный спейсер, Hairpin - РНК со шпилькой, Truncated - обрезанный спейсер
D. Dewran Kocak et al / Nature Biotechnology 2019
Обсуждая механизм наблюдаемого феномена, авторы работы предположили, что шпилька на конце спейсера ингибирует формирование комплекса РНК-ДНК (так называемой R-петли), которое необходимо для нуклеазной активности Cas-белка, в случае неточного спаривания ДНК-РНК, и таким образом, предохраняет систему от нецелевой активности. Самое главное в таком способе увеличения специфичности — его универсальность, так как направляющая РНК используется всеми CRISPR-системами, и ее просто синтезировать.
Посмотреть своими глазами, как работает CRISPR-Cas9 в клетке, можно
.
Дарья Спасская
Эффективнее всего себя показала композиция «We Will Rock You»
Швейцарские ученые внедрили механочувствительные рецепторы в клетки, способные высвобождать инсулин, и они стали реагировать на звуковые волны: ионные каналы впускали положительно заряженные ионы кальция, что заставляло содержащийся в них инсулин сливаться с мембраной и высвобождаться наружу. Эффективнее всего этот процесс происходил под песню «We Will Rock You» группы Queen: у мышей, которым вживили эти клетки, после прослушивания песни заметно снизился уровень глюкозы в крови. Эксперимент описан в журнале The Lancet Diabetes & Endocrinology. Слуховые косточки преобразуют акустические волны звука в механические колебания, которые активируют механочувствительные ионные каналы в волосковых клетках. Вход ионов в клетку приводит к деполяризации мембраны и созданию потенциала действия. Подобные механочувствительные ионные каналы распространены повсеместно у всех организмов, в том числе бактерий, что может быть использовано для генной терапии различных заболеваний: встраивание подобных рецепторов и их активация могли бы менять потенциал действия клетки и, как следствие, ее активность или даже функцию. Однако системная доставка низкомолекулярных триггерных соединений затруднена из-за их иммуногенных эффектов, а физические триггеры, такие как свет, ультразвук, магнитные поля, радиоволны, электричество и температура, не всегда удобны в практическом применении. Ученые из Швейцарской высшей технической школы Цюриха под руководством Мартина Фуссенеггера (Martin Fussenegger) создали стабильные трансгенные клональные линии клеток, способные высвобождать инсулин, которые конститутивно экспрессируют механочувствительные рецепторы Piezo1 млекопитающих или бактериальные механочувствительные рецепторы MscL. Уровень звука в 60 децибел при частоте 50 Герц, который находится в пределах безопасного диапазона для человеческого уха, эффективно активировал эти рецепторы, что приводило к индукции высвобождения инсулина. Визуализация MscL-положительных и MscL-отрицательных клеток показала значительно более высокие уровни внутриклеточного кальция в первой популяции клеток, что означает массовый вход кальция в клетку при активации механорецепторов. Затем ученые проверили влияние различных жанров музыкальных произведений на высвобождение инсулина. Выяснилось, что популярная музыка с низкими басами и саундтреки к фильмам вызывали максимальное выделение инсулина, в то время как реакция на классическую музыку и гитарную музыку была более разнообразной и зависела от композиции. Песня «We Will Rock You» группы Queen высвобождала почти 70 процентов инсулина в течение пяти минут. В эксперименте на мышах с диабетом и трансгенными клетками эта песня приводила к выработке достаточного количества инсулина, чтобы быстро снизить колебания гликемии во время тестов на толерантность к глюкозе. На втором месте по эффективности оказался саундтрек к фильму «Мстители». Клетки активировались только в том случае, если звуковые волны непосредственно воздействовали на кожу над местом имплантации не менее 15 минут Речь, наушники, низколетящие самолеты, газонокосилки, пожарные машины и гудки не приводили к нежелательной секреции инсулина при восприятии с разных расстояний и направлений. Таким образом, эти клетки защищены от незапланированного выброса инсулина. Ученые считают, что эту разработку можно рассматривать как потенциально реальную замену уколам инсулина для людей с диабетом. Ранее мы рассказывали, что введение инсулина в нос помогло людям с деменцией улучшить их когнитивную функцию.