Крутящаяся молекула измерила натяжение клеточной мембраны
Швейцарские ученые создали молекулу, группы в которой могут поворачиваться относительно друг друга в ответ на внешнее давление и менять характеристики флуоресценции. Исследователи показали, что это свойство можно использовать для измерения напряжения в клеточных мембранах. Статья опубликована в журнале Nature Chemistry.
Клеточная мембрана выступает в качестве барьера между содержимым клетки и внешней средой или содержимым органеллы и внутриклеточной средой. Мембрана состоит из белков и липидов и может растягиваться. При этом расстояние между липидами увеличивается. Поскольку напряжение клеточной мембраны зависит от многих факторов и влияет на многие процессы, к примеру, препятствует эндоцитозу (поглощению внешнего материала клеткой), биологи пытаются изучить особенности механизмов растяжения.
Группа под руководством Орельена Ру (Aurelien Roux) из Женевского университета разработала новый метод измерения напряжения в клеточных мембранах. В его основе лежит органическая молекула с двумя флуоресцентными группами, соединенными углерод-углеродной связью. В обычном состоянии группы повернуты относительно друг друга из-за отталкивания между метильными группами и внутрикольцевыми атомами серы. При приложении достаточного внешнего давления группы в молекуле выравниваются и становятся параллельными.
Метод основан на том, что изменение ориентации флуоресцентных групп влияет на параметры флуоресценции, в частности на время жизни возбужденного состояния и интенсивность излучения. Исследователи решили использовать в качестве показателя давления именно время жизни, потому что результаты его измерения не зависят от параметров оптической установки, в отличие от интенсивности.
Изначально ученые проверяли работу метода на искусственных мембранах, созданных из однослойных липосом, к которым добавляли небольшое количество молекул-зондов. Эксперименты показали, что время жизни возбужденного состояния увеличивается пропорционально доле липидов, формирующих жидкоупорядоченную фазу, и «зажимающих» молекулы-зонды между собой.
Кроме того, ученые провели несколько экспериментов на настоящих клетках. В частности, они показали на примере эпителиальных клеток почек собак Мадин-Дарби, которые часто используются для биомедицинских исследований, что молекулы-зонды позволяют обнаружить различия в плотности упаковки липидов в различных областях клеточной мембраны.
Также исследователи проверили способность молекулы-зонда показывать напряжения в клеточной мембране. Они подвергали клетки осмотическому удару, при котором резкое изменение концентрации веществ, растворенных в окружающей клетки среде, приводит к резкому увеличению или уменьшению объема клетки из-за осмотических сил. Эксперименты показали, что время жизни возбужденного состояния молекул при флуоресценции линейно зависит от осмотического давления, причем эта зависимость специфична для конкретных типов клеток.
В прошлом году американские химики применили молекулярные моторы в качестве агентов, увеличивающих проницаемость клеточных мембран. Моторы работали в качестве сверла, проделывающего отверстие в мембране под действием определенной волны. Эксперименты показали, что с их помощью можно доставлять краситель в клетку.
Григорий Копиев
Для создания электрогенетического интерфейса использовали человеческие белки
Швейцарские исследователи разработали систему для искусственного управления экспрессией генов с помощью электрогенетического интерфейса, приводимого в действие постоянным током. В эксперименте с его помощью удалось контролируемо синтезировать инсулин пересаженными человеческими клетками в организме крысы, больной сахарным диабетом. Отчет о работе опубликован в журнале Nature Metabolism. Средства современной синтетической биологии позволяют создавать сложные генетические контуры управления клеткой, которые могут выполнять функции осцилляторов, таймеров, модулей памяти, линейных пропускателей, реле и сумматоров. В экспериментах они позволяли контролировать модели различных медицинских состояний, включая рак, бактериальные инфекции, хроническую боль и сахарный диабет. Как правило, такие контуры содержат генетический выключатель, который реагирует на низкомолекулярные соединения, но их применение ограничивают биодоступность, фармакодинамика и побочные эффекты. Поэтому в последнее время различные научные группы испытывают физические триггеры, реагирующие на свет, тепло, магнитные поля и радиоволны, однако их использование также ограничено биодоступностью, использованием нефизиологических кофакторов и возможной цитотоксичностью. Чтобы преодолеть эти ограничения, сотрудники базельского Научно-инженерного отделения биосистем (D-BSSE) Высшей технической школы Цюриха (ETH Zurich) под руководством Мартина Фуссенеггера (Martin Fussenegger) выбрали в качестве управляющего воздействия электрический ток. Низковольтный постоянный ток, подаваемый по электродам, быстро генерирует в тканях свободные электроны и радикалы, приводящие к образованию активных форм кислорода в низких, не цитотоксических концентрациях. Авторы работы взяли за основу человеческий Kelch-подобный ECH-связанный белок 1 (KEAP1), модулирующий иммунный противоопухолевый ответ. В обычных условиях он секвестрирует фактор транскрипции NRF2 и направляет его на разрушение протеасомами. При повышении концентрации активных форм кислорода он высвобождает NRF2, который перемещается в ядро клетки и связывается с элементами антиоксидантного ответа (ARE). Кратковременного действия тока от бытового элемента питания оказалось недостаточно для активации KEAP1/NRF2, однако их эктопическая постоянная экспрессия давала достаточный ответ. Исследователи ввели в клетки человеческих эмбриональных почечных клеток (HEK293) на вирусных векторах гены KEAP1, NRF2 и репортерного конструкта, кодирующего модельный гликопротеин SEAP (человеческую плацентарную секреторную щелочную фосфатазу) и управляющий ее секрецией синтетический промотор, содержащий оператор ARE. Полученная система, названная DART (DC-actuated regulation technology, технология регуляции с постоянным током в качестве актуатора), надежно вырабатывала искомый белок под действием тока из электродов в питательной среде, не вызывая других изменений в транскриптоме и цитотоксичности. Экспериментальным путем было показано, что оптимально 10-секундное воздействие тока напряжением 4,5 вольта от трех бытовых батареек АА или ААА. В качестве подтверждения концепции авторы работы ввели в клеточную линию, полученную из человеческих мезенхимальных стволовых клеток конструкт DART, вырабатывающий инсулин. Монослой таких клеток в гелевой капсуле поместили под кожу спины мышей, страдавших сахарным диабетом 1 типа. Их стимуляцию проводили током от трех батареек АА с помощью стандартных одобренных ВОЗ и FDA акупунктурных электродов ежедневно в течение 10 секунд. На второй день уровень глюкозы в крови животных пришел в норму и оставался на этом уровне в течение четырех недель эксперимента. Метаболические показатели при этом можно было регулировать, изменяя напряжение тока, продолжительность стимуляции и частоту сеансов. Исследователи рассчитывают, что DART откроет возможность для создания носимых электронных устройств для прямого управления метаболическими вмешательствами. По их мнению, электрогенетические интерфейсы представляют собой недостающее звено на пути к полной совместимости и интероперабельности электронных и генетических систем. В 2017 году американским биотехнологам удалось применить электрический ток для управления генами кишечной палочки (Escherichia coli). Для этого они использовали белок SoxR, который помогает бактерии справляться с окислительным стрессом.