Ученые сложили белковые оригами-тетраэдры в клетках печени мыши
Биохимикам удалось сложить трехмерные структуры заданной формы из полипептидной цепи. Для этого ученые сконструировали белковые спирали, складывающиеся друг с другом определенным образом при взаимодействии аминокислотных остатков. Белки, состоящие из спиралей с заданными свойствами, способны формировать структуры в виде тетраэдров, пирамидок и призм как в растворе, так и в живых клетках. Новый тип самосборных белковых наночастиц, по аналогии с ДНК-оригами, может найти применение как в биомедицине, к примеру, для доставки лекарств, так и в других приложениях. Работа опубликована в Nature Biotechnology.
Способность биологических полимеров формировать вторичную и третичную структуры привлекает биоинженеров, которые пытаются при помощи рационального дизайна заставить ДНК и белки складываться нужным образом. Формирование заданных структур нуклеиновыми кислотами благодаря свойству комплементарности известно как ДНК-оригами и давно и успешно используется для разных задач. К примеру, мы рассказывали, как собирающиеся нужным образом молекулы ДНК использовали для создания молекулярных наноножниц, доставки лекарств в раковые клетки, и даже для создания электронных микрочипов.
ДНК состоит всего из четырех структурных блоков (A,T,G,C), которые взаимодействуют друг с другом строго ограниченным образом (A «спаривается» с T, а G с C). Белковые цепочки состоят из 20 аминокислот, которые могут взаимодействовать друг с другом в гораздо более широком спектре путем электростатических и гидрофобных взаимодействий. Благодаря этому природные белки формируют несколько десятков определенных третичных структур, и ученые показали, что это далеко не предел.
Исследователям из нескольких институтов Любляны в сотрудничестве с коллегами из других европейских университетов удалось создать алгоритм, позволяющий проектировать дизайн новых частиц с заданной трехмерной структурой на основе существующих в природе спиральных белковых доменов. Чтобы продемонстрировать работу алгоритма, авторы работы сделали белки в виде тетраэдра, четырехгранной пирамиды и треугольной призмы. Эти белки оказались растворимы, хорошо складывались в бактериях, эукариотических клетках и даже в клетках печени живой мыши.
В основу самосборных структур легли спиральные белковые домены типа coiled-coil (их можно назвать «суперспираль», хотя устоявшегося термина для них в русском языке нет). Такие домены часто используются в природе для взаимодействия белков друг с другом.
В эксперименте одна полипептидная цепь, то есть один белок, формировала одну геометрическую фигуру. Самая большая полипептидная цепь в эксперименте состояла более чем из 700 аминокислот. Ребрами фигуры служили те самые «суперспирали», которые образовывались при взаимодействии гидрофобных и заряженных аминокислотных остатков в составе отдельных спиралей. Отдельные домены были разделены гибкими линкерами, позволяющими формировать углы. Форму частиц, полученных in vitro, исследователи подтвердили при помощи электронной микроскопии и ряда физических методов.
Чтобы продемонстрировать применимость полученных белковых наночастиц в живых системах, авторы работы сначала экспрессировали белковые тетраэдры в бактериях и показали, что в отличие от белков, полученных в предшествующих работах, такие частицы хорошо складываются в клетках и при этом растворимы, то есть в нужном виде содержатся в цитоплазме.
На следующем этапе тетраэдры экспрессировали в клетках человека. Для того чтобы подтвердить правильную сборку структуры внутри клетки, авторы «пришили» к разным концам белковой молекулы половинки репортерного белка. Если белковая цепочка складывалась в нужную структуру, из половинок собирался целый репортер, способный светиться. Оказалось, что фигуры собираются правильно и в клеточной линии, и в клетках печени мыши, куда исследователи доставили генетические конструкции, кодирующие тетраэдры. Дополнительно ученые подтвердили, что такие белковые частицы, хотя и не встречаются в природе, не активируют внутриклеточные защитные реакции и не вызывают иммунного ответа в организме.
Самосборные белковые частицы с заданной формой, по словам исследователей, могут найти применение в разных областях молекулярной терапии. Такие белки можно использовать не только как средство доставки (по аналогии с ДНК-структурами), но и, к примеру, для создания генетически кодируемых вакцин, при помощи которых в организме синтезируются наночастицы, содержащие на своей поверхности антигены.
Мы писали, что ранее ученым удалось создать гибридные наночастицы, состоящие из ДНК и белка.
улучшили способность ДНК-структур к самосборке.
Это облегчило симптомы поражения мышц и нервов
Выращивание дрозофил с дефектом первого комплекса дыхательной цепи в среде с комбинацией 5-аминолевулиновой кислоты, гидрохлорида и железа натрия цитрата (5-ALA-HCl + SFC) увеличивает выработку АТФ за счет повышения активности второго и четвертого дыхательных комплексов. Активность первого комплекса при этом не меняется. Кроме того, у дрозофил снижалось накопление лактата и пирувата, которое происходит при дефекте первого комплекса, что, по-видимому, облегчало симптомы поражения мышц и нервов. Исследование опубликовано в Human Molecular Genetics. В митохондриях происходит окислительное фосфорилирование — многоэтапный процесс, в ходе которого окисляются восстановительные эквиваленты — восстановленные никотинамидадениндинуклеотид (НАДН) и флавинадениндинуклеотид (ФАДН2), — и вырабатывается АТФ. Происходит последовательный перенос электронов по дыхательной цепи — группе дыхательных ферментов в мембране митохондрии. Всего в цепи участвует пять комплексов дыхательных ферментов. Нарушение переноса электронов по дыхательной цепи сопровождается снижением выработки АТФ и вызывает митохондриальные заболевания. Наиболее часто «ломается» первый комплекс — НАДН-КоQ-оксидоредуктаза, или НАДН-дегидрогеназа. Его дефицит поражает органы и ткани с высокими энергетическими потребностями, таких как мозг, сердце, печень и скелетные мышцы. Обычно это проявляется тяжелыми неврологическими синдромами: например, наследственная оптическая нейропатия Лебера, синдром MELAS или синдром MERRF. Хотя первый комплекс отвечает за поступление наибольшего количества электронов в дыхательную цепь, второй комплекс — ФАД-зависимые дегидрогеназы, — работая параллельно с первым, также отвечает за вход электронов в цепь, передавая их, как и первый комплекс на убихинон (коэнзим Q). Потенциально повышение активности второго комплекса могло бы нивелировать снижение активности первого. Поскольку второй, третий и четвертый дыхательные комплексы и цитохром с содержат гемовые структуры, команда ученых под руководством Канаэ Андо (Kanae Ando) из Токийского столичного университета решили проверить, насколько эффективно будет применение предшественника гема 5-аминолевулиновой кислоты для повышения активности этих комплексов и восстановления синтеза АТФ у дрозофил с дефектом первого комплекса. Сначала ученые отключили у дрозофил ген, гомологичный NDUFAF6 и ответственный за экспрессию одного из регуляторных белков первого комплекса. У таких дрозофил мышцы были тоньше, хрупче и иннервировались хуже, чем у насекомых без нокдауна гена. Кроме того, самцы с неработающим геном погибали намного быстрее самок, и у них развивались более грубые нарушения опорно-двигательного аппарата. Затем ученые проанализировали как нокдаун гена первого комплекса влияет на экспрессию и активность других комплексов. Выяснилось, что нокдаун увеличивает экспрессию генов третьего и пятого комплексов, и снижает — четвертого. При этом активность второго и четвертого комплекса значительно повышалась после нокдауна у самок дрозофил. Ученые не обнаружили нарушений в процессах утилизации активных форм кислорода, однако у дрозофил обоих полов без работающего гена первого комплекса накапливался лактат и пируват. Чтобы проверить влияние комплекса 5-аминолевулиновой кислоты, гидрохлорида и железа натрия цитрата (5-ALA-HCl + SFC) на митохондрии дрозофил с нокаутированным геном, их выращивали в среде, содержащей этот комплекс. Такое воздействие значительно повышало уровни АТФ у самцов и самок дрозофил, при этом количество копий митохондриальной ДНК не изменялось, то есть препарат не увеличивал количество митохондрий. Экспрессия и активность дефектного первого комплекса никак не изменились, а активность второго и четвертого комплексов выросли у самцов. В целом, повышенная экспрессия генов третьего комплекса и активность второго и четвертого комплексов смягчали дефектные фенотипы. Помимо этого 5-ALA-HCl + SFC снижало накопление лактата и пирувата у самцов и самок с нокдауном гена первого комплекса, что потенциально смягчает метаболические нарушения, вызванные дефицитом первого комплекса. У самцов и самок мух-дрозофил, которых лечили 5-ALA-HCl + SFC, наблюдалось меньше дефектов опорно-двигательного аппарата, а продолжительность их жизни значительно увеличилась. Ученые рассчитывают проверить эффект такого лечения на животных с более сложным строением, чтобы подтвердить универсальность такого подхода к лечению митохондриальных нарушений. Не всегда нужна мутация, чтобы нарушить работу дыхательной цепи. Недавно мы рассказывали про то, что большое количество натрия из потребляемой соли нарушает дыхательную цепь митохондрий в регуляторных Т-лимфоцитах. Это приводит к активации аутоиммунных процессов.
