Компьютер научили попадать в отдельные нейроны
Ученые из Массачусетского технологического института разработали технологию автоматизации метода локальной фиксации потенциала, который позволяет изучать электрическую активность отдельных клеток. В отличие от других разработок по автоматизации этого метода, новая технология позволяет изучать одиночные нейроны. Исследователи заявляют, что точность автоматизированной методики сравнима с результатами опытных специалистов в этой области, выполняющих ту же операцию вручную. Статья, посвященная разработке, опубликована в журнале Neuron. Помимо этого исследователи опубликовали на своем сайте инструкции по самостоятельной сборке и настройке такой системы, а также программное обеспечение для ее работы.
Зачастую ученые, занимающиеся изучением нейронов и взаимодействия между ними, используют метод локальной фиксации потенциала. Его можно представить следующим образом: специальная стеклянная пипетка с очень тонким концом подносится к изучаемой клетке и прикрепляется к ее мембране, после чего ученый может изучать ионные токи, проходящие через мембрану. Этот метод особенно полезен для изучения нейронов, взаимодействующих с другими клетками за счет электрических импульсов.
Несмотря на важность этого метода для исследования нейронов, он имеет существенный недостаток — для выполнения такой операции требуется серьезная подготовка и опыт, особенно, когда эксперимент проводится in vivo. И даже при большом опыте процент успешного прикрепления к мембране достаточно низок. Существуют некоторые разработки, позволяющие хотя бы частично автоматизировать процесс, но они не позволяют изучать конкретные клетки, интересующие ученых, поскольку клетки могут сдвигаться по мере продвижения пипетки.
Исследователи из MIT решили эту задачу с помощью новой системы. Основа оборудования системы — двухфотонный лазерный микроскоп, в котором образец облучается излучением одной длины волны, которое вызывает флуоресценцию с другой длиной волны. Ученые проводили эксперименты на мозге мышей, с клетками, экспрессирующими флуоресцентный белок. Сначала система получает изображения, из которых определяет помеченные флуоресцентным маркером клетки, и предлагает ученому выбрать интересующий его нейрон. Затем система автоматически приближает пипетку, отслеживая и адаптируя ее положение в реальном времени. После этого система анализирует изменения сопротивления пипетки, и после установления так называемого гигаомного контакта с клеточной мембраной пипетка прикрепляется к ней и ученые могут производить измерения электрической активности.
Ученые утверждают, что система успешно проводила эксперимент примерно в 20 процентах случаев, и превзошла их личные результаты для аналогичных ситуаций. Они считают, что их методика может сэкономить много времени, которое сегодня тратится на непосредственно эксперимент, и позволит направить его на более качественное планирование экспериментов и анализ результатов. Также разработка важна потому, что обычно в процессе исследования ученые концентрируются на конкретном типе нейронов, ассоциированных с теми или иными процессами и заболеваниями — таким образом, исследователи могут быть заинтересованы в точечном исследовании конкретных нейронов.
В прошлом году ученые усовершенствовали интересный метод для изучения взаимодействия между нейронами. Он заключается во внедрении модифицированного вируса бешенства, который проходит через синапсы и позволяет маркировать нейрональные связи за счет внедренного гена, экспрессирующего флуоресцентный маркер.
Григорий Копиев
И еще четырех видов опухолей
Британские и датские иммунологи обнаружили на цитотоксических T-лимфоцитах рецептор, узнающий одновременно три разных опухолевых антигена. Пациент, у которого были обнаружены эти Т-клетки, смог достичь полной ремиссии меланомы четвертой клинической стадии. Такое строение T-клеточных рецепторов не дает клеткам опухоли ускользнуть от противоопухолевого иммунитета. Похожие типы Т-клеточных рецепторов есть и у здоровых людей, но их роль в противоопухолевом иммунитете пока неясна. Исследование опубликовано в виде статьи в журнале Cell. Клеточная терапия онкологических заболеваний направлена на введение в организм Т-лимфоцитов, узнающих фрагменты белков опухоли, выставляемые клетками на поверхности белков главного комплекса гистосовместимости (HLA-антигенов). Она позволяет добиться ремиссии во многих случаях, при которых другие виды лечения неэффективны. Но врачи часто сталкиваются с ускользанием опухолевого клона от такого иммунитета. Иногда достаточно нескольких месяцев, чтобы опухолевые клетки перестали экспрессировать маркер, который должны были узнавать лимфоциты. Хотя большинство Т-лимфоцитов узнают один эпитоп, некоторая часть из многообразия Т-клеточных рецепторов, образующихся в процессе созревания Т-клеток, узнает не один, а сразу несколько антигенов. Такие клетки есть и у здоровых людей, и у пациентов с аутоиммунными болезнями. Рецепторы, нацеливающие иммунную систему сразу на несколько молекул-мишеней, могли бы повысить эффективность клеточной терапии. Ведь даже если с поверхности опухоли исчезнет один антиген, то иммунный ответ против второго сохранится, и лечение останется эффективным. Шаг в сторону использования этого принципа в терапии сделала группа онкологов и иммунологов из Великобритании и Дании под руководством Эндрю К. Сьюэлла (Andrew K.Sewell) из Университета Кардиффа. На протяжении последних 15 лет они занимаются клеточной терапией меланомы. В рамках клинических исследований врачи забирали у пациентов клетки крови, отбирали среди них Т-лимфоциты, тропные к меланоме, и после культивации in vitro вводили клетки обратно пациентам. В одном из исследований, проведенном в 2011-2014 годах, участвовал пациент с четвертой клинической стадией меланомы, у которого клеточная терапия позволила добиться десятилетней ремиссии болезни (обычно же медианная продолжительность жизни с момента постановки диагноза у таких пациентов не превышает года). Ученые решили детально исследовать, с какими особенностями Т-клеточного ответа это было связано. Как выяснили иммунологи, почти вся противоопухолевая активность лимфоцитов пациента была связана одним лимфоцитарным клоном (его обозначили MEL8), который реагировал in vitro не только на меланому, но и на клетки острого миелолейкоза, опухоли молочной, предстательной и поджелудочной железы от других пациентов с таким же типом HLA-антигена (гаплотип HLA A*02:01, наиболее распространенный в мире). Это было неожиданно, ведь рецепторы этих Т-клеток чувствительны к белку мелану A, специфичному для меланоцитов и происходящих от них опухолей (включая меланому). Авторы создали библиотеку из 936 миллиардов декапептидных последовательностей и оценили in silico сродство рецепторов MEL8 к олигопептидам, связанным с HLA A*02:01. Такой скрининг позволил отобрать 500 пептидов, представленных в протеоме человека. Три из них — участки белков мелана А, BST2 и IMP2 — имели сродство к Т-клеточному рецептору MEL8 in vitro и при этом экспрессировались меланомой. У всех трех декапептидных последовательностей нашлась гомология и на уровне аминокислотной последовательности, и на уровне третичной структуры, что было подтверждено рентгеноструктурным анализом. Т-клетки, у которых есть рецепторы, тропные одновременно к мелану А, IMP2 и BST2, были обнаружены у здоровых добровольцев и у одного пациента с хроническим лимфолейкозом, но их количество было невелико. Обнаруженный вид поливалентного рецептора можно использовать и для лечения других пациентов: исследователи секвенировали последовательность Т-клеточного рецептора и трансдуцировали этой последовательностью другие линии лимфоцитов в рамках своих экспериментов. Следовательно, есть предпосылки для создания эффективной клеточной терапии опухолей или противоопухолевой вакцины. Впрочем, пока невозможно говорить, насколько безопасной было бы такое лечение, ведь исследование британских и датских ученых основано лишь на единичных наблюдениях пациентов с опухолями. Кроме того, распознавание эпитопов Т-клеточным рецептором зависит от варианта HLA.антигена, имеющегося у данного конкретного человека, и распространенность полимодальных Т-клеточных рецепторов у носителей разных вариантов HLA может отличаться. Даже сильного иммунного ответа против клеток меланомы может оказаться недостаточно для победы над болезнью — на эффективность лечения могут влиять такие факторы, как уровень тестостерона.