Прометилировали до седьмого колена

Очень может быть, что унаследовать от родителей можно не только гены. Но из доказательств у нас — только отдельные истории. Вот, например: женщина страдает раком кишечника, потому что ген, который отвечает за починку клеточной ДНК, у нее не работает. Но он и не сломан. Последовательность гена правильная — однако на нем висят лишние метильные группы, а на них садятся белки, запрещающие считывание. И ген молчит. 

У детей этой женщины — точно такой же рак кишечника, и метильные группы на том же самом гене.

Возможно, это значит, что люди передают потомкам не только гены, но и эпигенетические метки — указания, какие из этих генов использовать, а какие нет. А если так, то получится, что наследование у людей выходит за рамки законов Менделя. И придется пересматривать представления о том, как оно устроено: и молекулярным биологам, и врачам, да и обычным людям, которые задумываются о том, какие риски они могут передать собственным детям.

Но для начала нужно доказать, что эпигенетическое сходство родителей и детей — это закономерность, а не совпадение. И что метильные метки, которые появились у двух детей женщины с раком кишечника, перешли к ним по наследству от матери, а не возникли у всех троих независимо — по каким-то внешним или внутренним причинам.

Метка по наследству

У лабораторных животных ученые тоже встречали что-то, похожее на эпигенетическое наследование. Например: обычных мышей откармливают, вызывая ожирение. Потом забирают у них половые клетки, получившиеся эмбрионы пересаживают здоровым суррогатным матерям — и рождается мышонок с избыточным весом.

Откуда у него взялся этот вес? Дело явно не в самих генах — потому что его родители были обычными мышами, пока их не начали откармливать. Если бы мышонка вынашивала собственная мать, то можно было бы предположить, что ее ожирение повлияло на плод за время беременности, — но использование суррогатной матери делает и этот аргумент нерабочим. 

Поэтому исследователи предполагают, что дело в эпигенетике: за время откармливания клетки мышей (в том числе и половые) навесили какие-то лишние метки на свою ДНК — и эти метки перешли по наследству к мышатам. Но в таких работах, как правило, речь не идет о конкретном механизме — только о факте. С объяснением которого все сложно.

Заполнить этот пробел взялись биологи под руководством Хуана Карлоса Исписуа Бельмонте (Juan Carlos Izpisúa Belmonte) из Института Солка. Мы уже рассказывали о том, как Бельмонте решает задачи на стыке молекулярной биологии и эмбриологии. Так, например, он руководил проектом по созданию химерных зародышей обезьяны и человека. А потом выращивал мышиных зародышей из одной клетки — и тем самым фактически придумал еще один метод клонирования (об этом в материале «Здравствуй, гхола!»). На этот раз группа Бельмонте задалась целью воспроизвести эпигенетическое наследование в эксперименте. 

Вот как был устроен эксперимент:

1. Ученым нужен был участок в геноме, где метильных меток обычно не бывает: чтобы гарантировать, что любая метка на этом месте — искусственная. В качестве такого участка они выбрали CpG-островки — длинные последовательности из цитозина и гуанина. Такие участки часто бывают в регуляторных областях, то есть тех, которые отвечают за работу того или иного гена. И в клетках они обычно не метилированы.

2. Нужны гены, по работе которых можно будет заметить эффект от наследования метильных меток. Бельмонте и коллеги выбрали два: Ankrd26 и Ldlr, оба связаны с ожирением. Что бывает с нокаутными по ним мышами — то есть теми, у которых эти гены вырезаны, — хорошо известно. Без Ankrd26 начинается ожирение, без Ldlr растет уровень холестерина в крови. Соответственно, если навесить метильные метки на CpG-островок перед каким-то из этих генов, он замолчит — и эффект должен быть таким же, как если бы ген вырезали целиком.

3. Нужен способ точечно навесить метки на конкретный островок. Для этого ученые встроили посреди островков кусочек ДНК совсем другой последовательности. Она ничего конкретного не кодирует, но, что важнее, не несет повторов CG — а это привлекает клеточные белки, которые вешают на такие последовательности метильные группы. Забитый метильными группами островок будет неактивен — а поскольку он управляет активностью соседнего гена, умолкнет и тот. Что, собственно, исследователи и проверили: в мышиных клетках, которым досталась такая вставка в геном, целевые островки были метилированы, а подконтрольные им гены не работали.

После этого ученые вырезали бессмысленную вставку из генома обратно — и посмотрели, что происходит в клетках с метилированием CpG-островков. Но когда последовательность мышиной ДНК вернулась к своей норме, лишние метки на островках остались, а следующие за ними гены не работали — то есть появилась эпигенетическая мутация.

Дальше ученые проверили, как эти метки поведут себя в организме мышей. Для этого они взяли культуру эмбриональных стволовых клеток и внесли в них эпигенетические мутации перед генами Ankrd26 или Ldlr, врезав и вырезав «липучку» для метильных групп в соседние с ними CpG-островки. Причем взяли за основу клетки от мыши темного цвета. А затем ввели эти клетки в зародыши мышей белого цвета. В результате на свет родились несколько гибридов, некоторые полностью темные — то есть в них отредактированные клетки составили большую часть в зародыше.

В клетках этих гибридов были почти полностью метилированы CpG-островки перед целевыми генами. На месте были и соответствующие симптомы: например, темные мыши, у которых должен был быть выключен ген Ankrd26, выросли заметно толще своих контрольных сородичей.

Осталось проверить, что эти искусственные эпигенетические метки наследуются. И мышей начали размножать: черных химер скрестили с обычными белыми мышами. В первом поколении многие мышата унаследовали по одной копии гена Ankrd26 от черного родителя — и перед этой копией был точно такой же почти полностью метилированный островок. Эти животные не страдали ожирением, поскольку от второго родителя, белого и не отредактированного, им достался рабочий ген с неметилированным островком. Но само метилирование никуда не делось: оно передалось и внукам химер (тем из них, кому досталась дедовская хромосома), и правнукам. Только в четвертом поколении количество метильных групп на островке перед Ankrd26 стало снижаться.

В аналогичном эксперименте с геном Ldlr лишние метильные метки тоже передавались по наследству — и их не становилось меньше аж до шестого поколения мышей. 

Эти результаты уже сложно считать случайностью. Проще признать, что мыши действительно унаследовали эпигенетические метки своих предков. 

Но здесь возникает еще одна проблема — совершенно непонятно, как это происходит.

Так быть не должно

Ни у кого не возникло бы вопросов, если бы речь шла о бактериях, растениях или червях, — у них эпигенетическое наследование находили уже не раз. Но жизненный цикл млекопитающих и их половых клеток специально устроен таким образом, чтобы этого не допустить.

Клетки взрослого организма имеют свою специализацию: в нервной ткани живут нейроны, в мышце — миоциты, в глазу — палочки и колбочки. Но когда-то в своей стволовой молодости они, естественно, были совершенно одинаковыми универсалами. Просто по мере обретения специализации клетки навешивают себе метильные группы на не нужные им гены — и тем самым делают их недоступными для считывания. Поэтому для клеток каждой специальности характерен свой набор эпигенетических меток.

У сперматозоидов и яйцеклеток тоже есть специализация — они половые. Чтобы в результате их союза получить эмбриональные клетки, из которых можно дальше строить новый организм, все эти метки нужно стереть. Поэтому после оплодотворения в зиготе начинается первая волна репрограммирования: клетка снимает с доставшихся ей генов метки, которые делали из ее родителей сперматозоид и яйцеклетку. У мышей эта волна заканчивается к седьмому дню развития. С этого момента зародыш — tabula rasa, и сам дальше решает, кем ему (в смысле, его клеткам) быть.

Так метильные группы снова начинают появляться в геноме эмбриональных клеток. В каких-то участках их ставят всегда: например, там, где сидят ретротранспозоны, — потому что важно их вовремя заблокировать. Другие метки появляются во время дифференцировки, когда клетки зародыша выясняют, кому быть плацентой, кому — нервной системой, а кому — кишкой.

Но где-то в районе девятого дня развития в зародыше мыши появляется особенная группа клеток — предшественники половых клеток, которым предстоит поселиться в яичках или яичниках и дать начало сперматозоидам и яйцеклеткам. Свою карьеру они начинают с того, что снова стирают метильные группы по всей длине своего генома. И лишь после второй волны репрограммирования начинают развешивать метки заново — и копят их до следующего оплодотворения.

Получается, что по дороге от родителей к мышонку искусственная эпигенетическая метка переживает по меньшей мере одну волну репрограммирования (а если речь о половых клетках отпрыска, то две). И там, где все прочие метки стираются, она почему-то удерживается на своем месте.

Нечистый лист

Чтобы выяснить, как это возможно, Бельмонте вернулся к своим экспериментальным мышам. И посмотрел, что происходит с искусственными метками в обычных (соматических) клетках зародыша, в предшественниках половых клеток и в получившихся из них половых клетках.

Оказалось, что судьба метильной разметки может складываться двумя путями. Первый ученые увидели на примере зародышей с выключенным геном Ankrd26. До оплодотворения искусственные метки в половых клетках родителя-химеры покрывали почти 70 процентов CpG-островка. После оплодотворения их должна была стереть первая волна репрограммирования — но большинство остались на месте. Потом их стало чуть больше, а после второй волны — чуть меньше. То есть метки оказались очень стойкими: они вообще проигнорировали первую волну и чуть-чуть поддались второй. Но и то, потом быстро восстановили свою численность.

Второй вариант развития событий сложился у меток, которые выключали ген Ldlr (и еще одна из линий, которой выключали Ankrd26). В этих экспериментах метилирование цели было неполным — метки покрывали не больше половины нужного CpG-островка. Их судьба оказалась другой: вторая волна репрограммирования смыла их полностью. Они не появились в яйцеклетках и сперматозоидах у детей отредактированных родителей, но после того, как те встретились и зачали внуков, метки возникли снова — как будто из ниоткуда.

Получается, что, хотя большинство эпигенетических меток стираются подчистую, искусственные метки могут пережить сразу две волны репрограммирования (причем некоторые даже никуда не деваются, а другие возникают на прежнем месте). Значит, эти выжившие должны обладать какими-то особенными свойствами, и пока совершенно неясно, какими.

В еще одном контрольном эксперименте (о котором авторы работы упоминают вскользь, не вдаваясь в подробности) ученые навесили искусственные эпигенетические метки на те же места напрямую. То есть не встраивали и не вырезали ничего из мышиного генома, а просто с помощью фермента пришили метильные группы к оригинальной ДНК. И такие метки оказались нестойкими — они потерялись еще в процессе деления мышиных клеток в культуре.

Судя по всему, тот метод, который исследователи использовали для навешивания лишних меток, пробуждает в клетке какие-то дополнительные механизмы, которые помогают эти метки поддерживать. Причем в некоторых случаях получаются просто очень стабильные метки, которые даже не сотрешь до конца, а в некоторых — возникает стабильная память о метке. Вокруг метилированного островка образуется нечто, способное сохранить эту память на много дней вперед — с первых дней зародышевого развития мыши и до первых дней после зачатия ее потомков — и заставить клеточные ферменты вернуть эту метку на место.

Как выглядит эта память на молекулярном уровне, ученые сказать не берутся. Можно, конечно, предположить, что это мог бы быть какой-то комплекс белков или видоизмененные гистоны или особенная упаковка нитей ДНК — но тогда придется объяснить, как они сами выдерживают репрограммирование и почему не теряются по дороге. Так или иначе, вопрос об эпигенетическом наследовании после работы Бельмонте становится не яснее, а еще более запутанным — на сцене возникла чья-то тень, и ее обладателя нам еще только предстоит найти.