Живые страницы

Несколько лет назад сотрудники Шекспировской библиотеки Фолджера запустили проект Dustbunny. Участники проекта собирают пыль с полей книг из библиотечных фондов, а потом анализируют ДНК их читателей вековой давности. Недавно на страницах одной из книг, Библии XVII века, генетики обнаружили ДНК двух уроженцев Северной Европы, чья кожа, возможно, страдала от угрей. Проект Фолджеровской библиотеки — далеко не единственное исследование биомолекул, собранных со страниц книг и старинных артефактов, проведенное за последние годы. Мы решили вспомнить несколько самых интересных, на наш взгляд проектов (а заодно немного рассказать о методах исследования).

Подобные исследования развиваются на основе достижений двух научных дисциплин — геномики и протеомики. Геномика изучает геномы и гены, а протеомика — совокупность белков какой-либо ткани или организма. При этом если генетический материал способен сохраняться на протяжении сотен, в лучшем случае тысяч лет, то белки, поскольку они намного прочнее ДНК, позволяют заглянуть в совсем уж далекое прошлое — на миллионы лет назад. Поскольку именно в музеях всего мира собрано огромное количество образцов разной степени древности, специалисты по геномике и протеомике нередко работают именно там.

Так, благодаря протеомике ученым удалось узнать, какого цвета было оперение динозавров. Или отправиться не так далеко в прошлое и выяснить, где делали древнейший сыр (кстати, в нем нашлись опасные для здоровья бактерии). Или, заглянув буквально во вчерашний день, определить состав связующего вещества в красках на одном из полотен Эдварда Мунка (в основном это были яичные белок и желток).

Исследования протеома стали возможны благодаря развитию и удешевлению методов определения белков. Сейчас для анализа белков часто используют метод «снизу вверх» (bottom-up). Неизвестные белки с помощью ферментов протеаз расщепляют на фрагменты длиной 500-2500 аминокислот (пептиды такой длины удобно анализировать с помощью масс-спектрометрии) и анализируют с помощью хроматографии, совмещенной с масс-спектрометрией.

Хроматография позволяет разделить белки по весу. А с помощью масс-спектрометрии можно определить отношение массы к заряду ионов белка или пептида. Полученные масс-спектры сравнивают с известными значениями из баз данных и определяют, какой это белок.

Особенный интерес эти исследования приобретают при работе с историческими артефактами, когда речь заходит о биологических «следах», оставленных конкретными индивидами на различных музейных экспонатах.

«Пыль клочьями»

По словам Майкла Уитмора, директора Шекспировской библиотеки Фолджера, проект Dustbunny (буквально «клок пыли») начался с приезда в Вашингтон Тури Кинг, ученого-генетика из Кембриджа, занимавшейся идентификацией останков английского короля Ричарда III, обнаруженных в 2012 году под автостоянкой в Лестере. Для того чтобы убедиться в подлинности костей, выделенную из них ДНК сравнили с ДНК одного из современных потомков бывшего монарха.

Ричард III — герой одной из самых известных пьес Уильяма Шекспира, поэтому сотрудники библиотеки Фолджера, крупнейшего центра по изучению шекспировского наследия на территории США, с энтузиазмом отнеслись к рассказу о том, как генетики могут помочь историкам, в частности историкам литературы, в исследовании прошлого. (Анализ останков Ричарда III подтвердил историческую правоту ряда сообщений Шекспира — и о сильно искривленной спине английского короля, и о том, что в битве под Босуортом в августе 1485 года он погиб, сражаясь в пешем строю.)

Именно тогда и возникла идея получить более легкий доступ к биологическому материалу людей, живших в Англии четыреста и более лет назад. Фолджеровская библиотека — вместилище множества раритетов шекспировского времени: книг, рукописей, бумажных документов. Современные ученые привыкли видеть в них прежде всего источник литературной информации. Но ведь это все артефакты, способные служить настоящим биоархивом.

Когда-то над этими рукописями и книгами часами сидели их создатели и первые читатели, касавшиеся их руками, оставлявшие на них частицы кожи и волосы. Впоследствии те же книги хранились в прохладных помещениях веками, подчас больше никем не тревожимые. По словам Уитмора, его сотрудники регулярно просматривают старые издания, следят за их состоянием и при необходимости проводят восстановительные работы. И на всех этих этапах из книг и рукописей сыплется пыль. Прежде ее просто сдували, теперь стало ясно, что она представляет собой ценный материал для анализа.

Первой на анализ отдали пыль, собранную в складках страниц Библии, изданной четыреста лет назад. Ответ пришел одиннадцать месяцев спустя. Генетикам удалось обнаружить в образцах митохондриальную ДНК двух человек и определить их гаплотип. Это, в свою очередь, позволило ученым установить место их рождения. С высокой вероятностью, оба оказались выходцами из Северной Европы.

Более того, в образцах пыли были найдены бактерии, позволившие предположить, что эти двое страдали от угрей на коже.

Это открытие поставило перед учеными вопрос о возможности идентификации личности тех, кто оставил свои биологические «следы» на страницах старинных книг. Разумеется, сотрудники Шекспировской библиотеки Фолджера прежде всего думали о Шекспире. Как известно, рукописи Шекспира не дошли до нашего времени, но сохранилось несколько документов, на которых стоит его подпись.

В частности, в собрании фолджеровской библиотеки хранится документ 1602 года — окончательное соглашение о переходе прав на Нью-Плейс. Так назывался один из лучших домов в Стратфорде-на-Эйвоне, приобретенный Шекспиром еще в 1597 году. В силу ряда обстоятельств, купчую пришлось подтвердить пятью годами позже и она какое-то время хранилась в архиве семьи Шекспиров.

Майкл Уитмор не сообщил, передан ли этот документ генетикам для анализа. Но, в принципе, нет ничего невозможного в том, что в случае, если с него удастся собрать биологический материал, мы получим ДНК Шекспира. Конечно, его необходимо будет подтвердить, как в случае с ДНК, выделенной из останков Ричарда III. Прямые потомки Шекспира не живут среди нас — его род пресекся еще в XVII веке. Но они не нужны — достаточно, что сегодня существуют его отдаленные родственники по линии сестры.

Конечно, дело не в одном только в Шекспире. Протеомика и геномика открывают перед исследователями новые — и очень широкие — перспективы. Благодаря сохранившемуся в музейных запасниках биологическому материалу биологи получают непосредственный доступ к прошлому — как к людям, державшим в руках книги, пергамент и прочие документы и артефакты, так и к животным, из чьей кожи, например, был выделан тот же пергамент.

Исследования такого рода уже ведутся. Биологи анализируют фрагменты ДНК и белков, сохранившиеся на страницах средневековых артефактов, а затем определяют по базам данных, какому организму они принадлежали. И вот несколько примеров того, что уже удалось узнать ученым.

Тысячелетнее евангелие

Йоркское евангелие было изготовлено в Кентерберийском аббатстве Святого Августина на рубеже тысячелетий. Помимо текстов четырех евангелистов в нем сохранилось письмо от английского короля Кнуда Великого (правил в 1016-1035 годах) и документы на владение землей. Предположительно, английские короли передали рукописный свод одному из йоркских архиепископов около 1020 года. Это одна из немногих книг, написанная до 1066 года, то есть до норманнского завоевания Англии, которая пережила Реформацию и сохранилась до наших дней. Сейчас евангелие хранится в Йоркском соборе. В XIV-XVI веках на Йоркском евангелии приносили присягу перед вступлением в сан новоиспеченные священники епархии.

Исследователи из Йоркского университета под руководством Мэттью Коллинза изучили не только пергамент, на котором была написана книга, но и фрагменты ДНК и белки, оставшиеся от тех, кто держал ее в руках. Чтобы взять образцы и не повредить драгоценные страницы, ученые воспользовались обычным ластиком из поливинилхлорида. Они осторожно проводили им по полям, а собранные катышки собирали для анализа. Такой способ очистки широко применяют при консервации старинных книг.

На страницах евангелия сохранилась ДНК бактерий кожного микробиома. В том числе бактерии Propionibacterium (они могут вызывать угри) и стафилококки (Staphylococcus). Исследователи обнаружили даже бактерии Saccharopolyspora, которые повреждают коллаген и опасны для пергамента.

К удивлению ученых, бóльшая часть Йоркского евангелия оказалась написана на пергаменте из телячьей кожи, причем чаще использовалась шкура телок, а не бычков. Лишь несколько страниц, добавленных в XIV веке, были изготовлены из овечьего пергамента. Это вызвало удивление — казалось бы, в аграрном хозяйстве коровы должны были цениться выше, а на пергамент логичнее было бы пускать бычков.

Но авторы исследования объяснили это несоответствие. Судя по нескольким источникам, в 986-988 годах в Англии, Уэльсе и Ирландии среди коров бушевала эпидемия ящура и в это время погибла масса животных. Если «Йоркское евангелие» написали через два-три года после окончания эпидемии, на пергамент могли пойти шкуры умерших животных.

Кроме того, изготовители евангелия могли руководствоваться девизом «все лучшее — Богу» и специально использовали пергамент из шкур более ценных телок. Наконец, наши представления о высокой ценности телок, а не бычков, могут и не соответствовать действительности. В основном они опираются на древнеримские или более поздние средневековые источники XIII–XIV веков. Саксы же могли больше ценить быков, на которых пахали землю.

Книга-путешественница

С помощью методов протеомики итальянские химики установили, из кожи какого животного был изготовлен пергамент, пошедший на страницы знаменитой средневековой рукописи — «Библии Марко Поло». Ее история очень примечательна.

В 1271 году 17-летний Марко Поло вместе со своим отцом и дядей — купцами, торговавшими на Ближнем Востоке, — отправился ко двору монгольского хана Хубилая, основателя китайской династии Юань. Его старшие родственники уже побывали в ставке хана и вернулись в Венецию с его посланием к папе Римскому. Хубилай просил прислать ему масла из Иерусалима и христианских миссионеров. Венецианцы отправились сначала в Иерусалим, за монахами и маслом, а затем и в Китай. Через три с половиной года они добрались до столицы Хубилая.

В том же XIII веке в Сорбонне, одном из крупнейших средневековых европейских университетов, было изготовлено около десяти тысяч рукописных копий Библии на латыни «карманного» формата. Большую их часть купили студенты теологического факультета, священники и монахи. Около тысячи экземпляров сохранились до наших дней.

Один экземпляр в конце концов оказался при дворе хана Хубилая — вероятно, он прибыл туда с кем-то из иерусалимских миссионеров. В Китае книга пробыла почти 400 лет, пока в 1685 году ее не доставил обратно в Европу, в дар флорентийскому герцогу, миссионер-иезуит. С тех пор она хранится в Библиотеке Медичи Лауренциане и значится в каталоге как «Библия Марко Поло».

Летом 2012 года книга совершила еще один вояж в Китай, теперь на самолете, и ее экспонировали в Пекине на выставке, посвященной венецианскому путешественнику. Но перед этим книгу отреставрировали и заново исследовали. При этом ученые не ограничились уже привычными при исследовании старинных манускриптов инфракрасной спектроскопией и мультиспектральной съемкой. Они также отправили несколько микроскопических фрагментов пергамента химикам из Миланского технического университета.

Исследование пергамента решили провести не просто так. Библия была написана на очень тонких листах, и специалисты по средневековой истории и литературе предполагали, что на их изготовление пошла кожа эмбрионов ягнят. В «Библии Марко Поло» насчитывается 600 страниц, на каждую из них уходила половина ягнячьей шкурки. Если предположить, что хотя бы часть десятитысячного «тиража» была написана на подобном пергаменте, количество необходимых для этого эмбрионов окажется пугающим. На весь тираж потребовалось бы три миллиона эмбрионов.

Когда химики провели анализ протеома пергамента с целью определить его происхождение, они обнаружили, что средневековые переписчики использовали не ягнячью, а телячью кожу. В этом случае речь идет уже о куда меньшем числе животных.

Голод, чума и крысы

Очистка пергамента ластиком, конечно, более щадящая процедура, чем разрушение пергамента в научных целях, пусть даже и микроскопическое. Но и ее все же нельзя назвать полностью неинвазивной. Зато процедура сбора белков или пептидов с хрупких артефактов (книжных страниц, картин или одежды), которую разработал Глеб Зильберштейн, израильский физик российского происхождения, и его коллеги, кажется действительно безопасной.

Ученые предложили собирать белки с помощью полимерной пленки, покрытой синтетическими полимерами, к которым белки «прилипали» за счет гидрофобных или ионных взаимодействий. В частности, они применили свой метод к изучению средневековых документов из Милана.

В 1629-1631 годах на севере и в центре Аппенинского полуострова разразилась эпидемия чумы. Предположительно, ее принесли французские и немецкие войска, вторгшиеся в Северную Италию (в это время шла война за обладание Мантуанским герцогством), а потом болезнь распространилась по другим городам. Ее еще называют великой Миланской чумой, так как в городе за несколько месяцев 1630 года погибло около 60 тысяч человек — примерно половина тогдашнего населения.

В Государственном архиве Милана сохранились списки погибших во время эпидемии. В них заносили имя, возраст и причину смерти покойного (в подавляющем большинстве случаев morto di peste — «умер от чумы») и имя врача или цирюльника, поставившего диагноз. Израильские ученые собрали и проанализировали белки и пептиды со страниц реестра.

«Улов» оказался богатым: белки бактерий из семейства Yersiniaceae, к которому относится чумная палочка (Yersinia pestis) и более 50 человеческих и 130 крысиных и мышиных белков.

Списки заполняли в лазарете, по ночам, в окружении тараканов, блох и крыс, сновавших по палатам в поисках пищи. Судя по всему, писцы, одновременно с регистрацией умерших, периодически нюхали табак и ели — овощи, в том числе горох, морковь и картошку, кукурузу и рис. Похоже, мыши и крысы под покровом темноты делали вылазки на открытые страницы в поисках хлебных крошек или других остатков еды.

Так как ученые обнаружили на страницах реестров только растительные белки, они пришли к выводу, что рацион писцов был скуден и они не могли позволить себе дорогое мясо. К тому же, как уже говорилось, эпидемия чумы случилась во время войны, так что вся живность, скорее всего, досталась солдатам, грабившим города и деревни.

Булгаков, Чехов и немного морфина

Ранее та же группа авторов с помощью своей методики исследовала такие носители, как бумажные страницы семидесятипятилетней давности и столетнюю ткань.

В первом случае это была тетрадь с рукописью романа Михаила Булгакова «Мастер и Маргарита», в которой он делал записи на протяжении четырех последних лет жизни, с 1936 по 1940 год. Писатель закончил работу над рукописью за месяц до смерти. Умер он от нефросклероза — тяжелого заболевания почек.

Зильберштейн и его коллеги проанализировали десять случайных страниц из 127-страничной тетради. Они искали не только белки и пептиды, но и следы морфина (морфий, используемый в качестве болеутоляющего средства, является солью морфина). Предположительно, в последние годы Булгаков принимал сильные болеутоляющие средства.

Ученые действительно нашли на страницах рукописи следы морфина и его производных, вероятно, попавших на бумагу вместе со слюной или отпечатками пальцев. И подтвердили диагноз, поставленный писателю: они обнаружили белки N-ацетил-бета-D-глюкозаминидазу и нефрин, биомаркеры почечных заболеваний.

Во втором случае артефакт принадлежал Антону Павловичу Чехову. Русский писатель болел туберкулезом с молодости. Кровохарканье у него началось в 1884 году, через два года после того, как Роберт Кох обнаружил бактерию — возбудителя туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis), названного в его честь палочкой Коха.

Чехов умер в 1904 году, в сорокачетырехлетнем возрасте. Много лет спустя вдова писателя, актриса Ольга Книппер, подарила рубашку, которую он носил в последний день жизни, директору дома-музея в Мелихово, одному из главных музеев Чехова в России.

С помощью своей щадящей методики израильские ученые подтвердили диагноз, поставленный Чехову. Они проанализировали ткань рубашки, на которой сохранились пятна крови, и на воротнике нашли несколько белков палочки Коха.

Русакова Екатерина, Дмитрий Иванов