Скамейка запасных

На этой неделе исследователи из Университета Уэйк-Форест представили новую, значительно усовершенствованную модель трехмерного принтера для печати органов. С его помощью удалось создать искусственную модель кости черепа, ухо и мышцу. Причем все органы, пересаженные лабораторным животным, прижились. Мы решили вспомнить, какие еще органы и ткани ученые уже умеют создавать искусственно, и как это делается сегодня.

Практически любой орган человека состоит из трех тесно связанных структур. Во-первых, это соединительнотканный внеклеточный матрикс — разветвленная сеть коллагеновых волокон, которая придает органу форму и плотность, а также служит каркасом для клеток. Во-вторых, это клетки, благодаря которым орган выполняет свои биологические функции (во многих органах присутствуют несколько типов клеток). В-третьих, это сосудистая сеть, которая приносит артериальную кровь, насыщает ткани кислородом и питательными веществами, забирая у них углекислый газ и продукты обмена. Создание каждой из этих структур представляет отдельную сложную задачу тканевой инженерии.

Придать форму

Для получения внеклеточного матрикса используют два принципиально разных подхода. Можно создавать его с нуля — брать подходящий материал и, придумывая инженерные ухищрения, придавать ему нужную структуру. Альтернативный путь — взять «готовый» орган животного или мертвого донора и очистить его от всего лишнего, оставив только чистый каркас, свободный от клеток и не вызывающий реакции отторжения. Каждый из этих методов имеет достоинства и недостатки.

Искусственный матрикс синтезируют из синтетических и природных веществ. Из первых чаще всего используют полилактид (полимер молочной кислоты), полигликолевую кислоту и поликапролактон. Все они со временем рассасываются в организме без выделения вредных веществ, замещаясь натуральным внеклеточным матриксом. Природные материалы имеют белковую (например, коллаген) или углеводную (например, гиалуроновая кислота) природу. Для придания материалам нужной трехмерной сетчатой структуры в экспериментах и на практике используют множество способов (самосборку нановолокон, текстильные технологии, частичное растворение, вспенивание, электроспиннинг, трехмерная печать и другие). Эти методы не воспроизводят тонкостей микроструктуры органа и не формируют каркас для сосудистой сети. Поэтому они подходят лишь для органов с относительно простым строением — кожи, сосудов, хрящей и т.п.

Наиболее перспективная на данный момент технология получения внеклеточного каркаса сложных органов, например, сердца или почки — это децеллюляризация (очистка от клеток) соответствующего органа мертвого донора или подходящего по размеру животного (чаще всего свиньи). Для этого через сосуды органа медленно, в течение нескольких дней пропускают раствор моющего средства возрастающей концентрации. Когда все клетки удалены, матрикс промывают, и он готов к заселению клетками нового хозяина. Метод хорош и тем, что бесклеточный матрикс состоит из природного материала, который обеспечивает правильное прикрепление и пролиферацию клеток. Основной недостаток этой технологии заключается в том, что она разрушает микрососудистую сеть — капилляры, фактически состоящие из одного слоя эндотелиальных клеток, удаляются при промывании.

Из-за этого до клинического применения пока дошли только созданные таким методом дыхательные пути, а менее совершенное, на первый взгляд, искусственное получение матрикса уже используется в практическом и экспериментальном протезировании.

Заставить работать

Функциональную ткань изначально наращивали на матрикс, погружая его в питательный раствор с клетками и факторами роста. В последнее время все чаще с этой целью используют гидрогели, которые, застывая, обеспечивают равномерное распределение клеток, их лучшее закрепление и диффузию питательных веществ и газов. При использовании децеллюляризированного донорского матрикса раствор клеток и факторов роста пропускают через его сосуды.

Отдельную проблему представляет размножение и выживание клеток — в дифференцированной ткани их возможность делиться и развиваться ограничена длиной теломер («насадок» на концах молекул ДНК, необходимых для ее репликации, которые укорачиваются с каждым делением клетки). Решением этой проблемы может стать использование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, которые по способности пролиферировать и дифференцироваться близки к эмбриональным стволовым клеткам.

Снабдить воздухом и пищей

Создание сосудистой сети, как уже говорилось, представляет собой одну из наиболее сложных задач. Ни один из существующих методов не обеспечивает достаточной плотности и функциональности — капилляры либо протекают, либо их слишком мало для кровоснабжения органа (а чаще и то, и другое). Преодолеть эту проблему различными способами пытаются многие лаборатории мира. Более-менее обнадеживающие предварительные результаты получены при использовании микрожидкостных устройств из биорастворимых материалов, однако полноценную сосудистую сеть целого органа таким способом пока создать не удалось.

Оригинальное решение недавно предложили сотрудники американского Университета Вандербильта. Они получили полимерную сеть с толщиной волокон, близкой к капиллярам, с помощью аппарата для изготовления сладкой ваты. Затем эту сеть заливали гидрогелем с клетками и после его застывания вымывали полимер и пропускали через получившиеся микрососуды питательный раствор. Эта методика пока находится на начальных этапах разработки; полученный гидрогель с живыми клетками и сосудами не имеет внеклеточного матрикса.

Другой подход использовали ученые из китайского Северозападного аграрного и лесоводческого университета. Они начали не с целого органа, а с его структурной единицы (в данном случае — печеночной дольки). Микрожидкостное устройство, напоминающее ее по структуре, напечатали методом многослойной мягкой литографии, после чего укрепили его коллагеном и заселили клетками. Сеть искусственных долек исправно функционировала, но о создании таким способом целого органа речи пока не идет.

Тканевая типография

Принципиально другой поход к созданию искусственных органов — печать их на 3D-принтере. Именно его использовали сотрудники Университета Уэйк-Форест, передового мирового института в этой области. Регенеративной медициной в нем заведует пионер и крупнейший эксперт по 3D-печати органов Энтони Атала (Anthony Atala). Суть метода состоит в том, что создается полная трехмерная модель макро- и микроструктуры органа, после чего принтер, картриджи которого заполнены гидрогелем с различными типами клеток, печатает функционирующий орган с матриксом и сосудами.

Главный недостаток технологии заключается в том, что от перепада давлений при выходе из сопла принтера гибнет чрезмерно большое количество клеток, поэтому лучше всего пока обстоят дела с тканями, в которых мало клеток и много соединительной ткани (хрящи, кости и т.п.). Однако принтеры постоянно совершенствуются, как мы видим по недавней публикации, и есть надежда, что вскоре это препятствие удастся обойти.

Первые пациенты

Несмотря на обилие экспериментов в области тканевой инженерии и использованных в них технологий, число искусственных органов, пригодных для клинического применения, пока очень невелико, и все они не отличаются сложной структурой.

Например, на протяжении нескольких лет коммерчески производится и применяется искусственная кожа (Celaderm, Alloderm, Dermagraft и другие). Она не копирует микроструктуру настоящей ткани с эпидермисом и дермой, а представляет собой либо просто бесклеточный матрикс (при помещении в рану он заселяется собственными клетками пациента и прорастает сосудами), либо натуральный или синтетический матрикс с живыми клетками. Для закрытия не очень больших дефектов без образования рубцов этого вполне достаточно.

Используя бесклеточный матрикс для восстановления кожи и собственные клетки пациента, японские исследователи вырастили на питательной среде и успешно пересадили пациентам слизистую оболочку ротовой полости.

Еще одна ткань, сравнительно простая для создания методом тканевой инженерии — это хрящ. У взрослого человека он практически не кровоснабжается, из-за чего не восстанавливается. Однако крайне низкая потребность зрелого хряща в кислороде и питании существенно облегчает работу с ним — не приходится обеспечивать рост сосудов, поскольку хрящевая ткань получает все необходимое путем диффузии. В 2006 году сотрудники Бристольского университета успешно восстановили поврежденные коленные суставы с помощью искусственных хрящей, выращенных из клеток пациентов на матриксе из гиалуроновой кислоты.

Искусственно выращенная хрящевая ткань применялась еще в одной серии экспериментов на людях, и то с сомнительным результатом. Речь идет о работе хирурга Паоло Маккиарини, выполненной на базе Барселонского университета в Испании, Каролинского института в Швеции и Кубанского медицинского университета в Краснодаре. Он пересаживал трахеи и бронхи, выращенные на децеллюляризованном матриксе мертвых доноров из собственных мезенхимальных стволовых и эпителиальных клеток пациентов. После обвинений в нарушении этики проведения исследований и на основании данных о высокой смертности реципиентов Каролинский институт принял решение уволить Маккиарини.

Также следует упомянуть о работе Стивена Бадилака (Stephen Badylak) из Университета Питтсбурга. Он использовал высушенный порошок из децеллюляризированного матрикса свиного мочевого пузыря, содержащий коллаген и факторы роста, для устранения травматических дефектов тканей. Биосовместимый материал стимулировал стволовые клетки взрослых, благодаря чему удалось восстановить пациентам отрезанную пропеллером авиамодели фалангу пальца, мышцу, практически утраченную в ходе военных действий, и другие поврежденные ткани.

Пожалуй, наибольшего на данный момент успеха в экспериментах на людях добился уже упомянутый Атала. Его коллектив еще в 2000-х годах использовал 3D-принтер для создания матрикса мочевого пузыря. Полученные каркасы заселили клетками, забранными при биопсии, и вырастили полноценные органы, которые затем успешно пересадили пациентам.

В 2014 году Ясуо Куримото (Yasuo Kurimoto) из Медицинского центра Кобе пересадил женщине с возрастной макулярной дегенерацией сетчатку глаза. Ее вырастили сотрудники института RIKEN во главе с Масаё Такахаси (Masayo Takahashi) из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (за разработку технологии их получения соотечественник ученых Синъя Яманака в 2012 году получил Нобелевскую премию). Путем долгих экспериментов лаборатории RIKEN удалось направить дифференцировку этих клеток в пигментный эпителий сетчатки и получить плоский прямоугольник ткани размером 1,3 на 3,0 миллиметра, пригодный для трансплантации. Операция прошла без осложнений; кровотечения, отторжения и общего ухудшения самочувствия у 70-летней пациентки не наблюдалось. Однако о том, наступило ли восстановление зрения, сообщений не было.

На сегодняшний день этими работами клинические испытания органов, полученных методом тканевой инженерии, практически исчерпываются. Негусто, но известия из лабораторий позволяют в ближайшее время ожидать гораздо более впечатляющих результатов. О них мы расскажем в одном из следующих материалов.

Олег Лищук