Редактура продолжается

Два года назад мировое научное сообщество активно обсуждало намерение российского генетика Дениса Ребрикова отредактировать человеческий эмбрион с целью вылечить будущего ребенка от наследственной глухоты. Тогда Ребриков уже набирал в свой эксперимент испытуемых, хотя изо всех доказательств эффективности своей процедуры имел только публикацию об экспериментах над дефектными эмбрионами, где редактировал другой ген. Сегодня его команда на московской конференции по геномному секвенированию и редактированию впервые отчиталась о ходе работы над «глухим» проектом. Мы изучили презентацию с конференции и поговорили с докладчиком, Андреем Кривым, научным сотрудником лаборатории геномного редактирования Центра акушерства, гинекологии и перинатологии имени Кулакова.

Заболевание, о котором идет речь — аутосомно-рецессивная несиндромальная глухота, вызвано мутацией в гене GJB2. Ген кодирует белок, который необходим для установления контактов между нейронами во внутреннем ухе. В его отсутствие колебания чувствительных волосков не приводят к генерации сигнала, который бы передавался дальше в мозг — так человек теряет способность обрабатывать звуковые сигналы. В России, по данным Ребрикова, носителем такой мутации (конкретно, выпадение одной буквы в начале гена — 35delG) является каждый тридцатый.

Однако в гетерозиготном состоянии — когда мутация в гене GJB2 есть только на одной из двух копий хромосомы — она не опасна. Серьезные нарушения слуха возникают при наличии мутации на обеих хромосомах, что возможно, когда ребенок рождается у двух носителей. Шанс возникновения такой пары родителей «в вакууме», казалось бы, невелик —однако в действительности они возникают намного чаще, потому что глухие люди общаются и создают семьи внутри своего сообщества. И если большинство наследственных заболеваний можно при желании «отловить» и элиминировать при ЭКО, так как родители скорее всего будут гетерозиготами по вредной мутации, в случае с двумя тугоухими родителями отобрать «дикий» по GJB2 эмбрион невозможно. Именно поэтому Денис Ребриков остановился на этой модели, посчитав ее этически оправданной.

В лаборатории Ребрикова, который заведует подразделением в Центре акушерства и гинекологии им. Кулакова, уже были неплохие наработки по работе с эмбрионами — в 2018 году ученые опубликовали результаты внесения в человеческую зиготу мутации в гене CCR5, защищающей своего обладателя от заражения ВИЧ. Тогда генетики сообщили, что пять из восьми отредактированных бластоцист содержат нужную мутацию. Внесение делеции в CCR5 — довольно хорошо изученная модель, которую отрабатывали еще даже до распространения CRISPR с другими генетическими редакторами. В частности, до экспериментов группы Ребрикова, ее пытались внести в эмбрионы китайские исследователи, а некоторые из них пошли так далеко, что даже получили отредактированных детей, — правда, не очень успешно (о последнем можно прочитать в материале «Исправленная редакция»).

Полтора года назад, обсуждая исправление в человеческих эмбрионах мутации в гене GJB2, Денис Ребриков уверял, что система для этого уже практически готова, и что до ее испытаний остается буквально месяц, и он даже нашел пару, готовую родить отредактированного ребенка. Основные проблемы ожидались со стороны регуляторов (Минздрава), так как в отличие от Хэ, эксперимент планировалось провести строго официально. Видимо, ученые рассчитывали, что по аналогии с CCR5, особых проблем с самим редактированием быть не должно.

Чтобы внести правку в геном эмбриона при помощи системы CRISPR/Cas, вам нужно подобрать эффективную направляющую (гидовую) РНК против искомого гена, смешать с ферментом Cas9 и матрицей для устранения мутации. После введения вышеописанной смеси в зиготу РНК-гид должен «подвезти» к целевому гену Cas9, чтобы тот разрезал в этом месте двойную спираль ДНК. Затем в дело должна вступить уже система репарации клетки — а чтобы она залатала дырку в геноме нужным нам образом, используется «заплатка», матрица с генетическим материалом, который вы хотите подставить вместо целевого фрагмента. На выходе остается исправленная хромосома и здоровый эмбрион. Так это выглядит в теории.

А какие там проблемы?

На практике очень многое может пойти не так:

• РНК-гид может связаться не с тем местом и на хромосоме появится незапланированная (офф-таргетная) мутация;

• система репарации не обратит внимания на матрицу, и на месте разреза возникнет какая-нибудь другая мутация в результате неспецифического «зашивания» свободных концов ДНК;

• пока система редактирования будет работать, эмбрион будет делиться. Возможен сценарий, при котором в какой-то клетке исправится только одна копия хромосомы, а вторая останется не отредактированной, и из-за этого не все клетки эмбриона будут нести в себе нужные нам изменения (мозаицизм).

Чтобы перейти от экспериментов к пересадке отредактированного зародыша в утробу матери, нужно быть уверенным в том, что ничего из вышеперечисленного не случилось. Проверить же это можно только секвенированием, в ходе которого клетка уничтожается. Если отправлять на секвенирование весь зародыш, ни о какой трансплантации речи быть уже не может. Можно извлечь из зародыша несколько клеток (желательно как можно меньше, ведь из них строится весь организм будущего человека) и секвенировать их. Но чтобы довериться результатам такого анализа, нужно перед этим убедительно показать, что секвенирование отдельных клеток эмбриона надежно предсказывает состояние всех остальных. Для этого нужно в пилотных экспериментах выделить ДНК из всего эмбриона и отсеквенировать отредактированный участок.

Пока что никто не создал полностью застрахованной ото всех перечисленных казусов CRISPR-системы. Поэтому редактирование эмбрионов человека в большинстве стран до сих пор запрещено. В России этот вопрос до сих пор остается в «серой зоне» законодательства, хотя осенью 2019 года Минздрав отдельно комментировал инициативу Ребрикова по переходу к экспериментам с пересадкой зародышей матерям, заявив, что выдавать разрешение на подобное «преждевременно» и сослался при этом на то, что полностью солидарен с ВОЗ, позиция которого строго «против».

Кроме того, в последнее время у генетиков, которые работают с CRISPR/Cas, появилась новая забота. Оказалось, что разрезы, вносимые Cas9, могут приводить к выпадению больших участков одной из копий хромосом. В результате при анализе ДНК читается только оставшаяся копия и возникает ложное впечатление, что клетки гомозиготны по этому локусу (по этой причине это событие называют потерей гетерозиготности). К примеру, в одной из свежих статей в PNAS вероятность перестройки в одном из редактируемых локусов оценили в 16 процентов. Дело здесь не в точности нуклеазы — ведь пропажа происходит в нужном месте, а с особенностью работы белков репарации, которые в некоторых случаях уничтожают ДНК вокруг разреза, чтобы потом синтезировать ее заново. Чтобы учесть потерю гетерозиготности, необходимо развивать альтернативные методы анализа генома, такие как анализ количества копий генов.

Попытка #1: CCR5

В 2018 году, команда Ребрикова, работая над внесением в ген CCR5 мутации del32, добилась следующего:

1. Целевая замена в геноме произошла с эффективностью 60 процентов (пять из восьми эмбрионов были гомозиготны по мутации), и только два из восьми успешно отредактированных эмбрионов оказались мозаиками. То есть системы репарации использовали матрицу очень эффективно, хотя это скорее исключение из правила — эффективность репарации по этому механизму у мышей оценивается в 5-20 процентов, а в клетках человека и того меньше, и скорее всего, сильно зависит от гена — его последовательности ДНК и уровня активности. В статье 2017 года группа Шухрата Миталипова, которая тоже занималась редактированием эмбрионов методом CRISPR/Cas, отчиталась, что по хотя целевому гену они попали в 42 из 58 случаев, ДНК-заплатка для гена MYBPC3 у них не сработала.

2. О наличии нецелевых мутаций в статье вообще ничего не говорилось — хотя ученые отмечали, что их они собираются в будущем искать их с использованием высокопроизводительных систем секвенирования ДНК, путем сравнения с геномами родителей. Все необходимые мощности для этого у ученых имелись.

Поэтому, когда группа Ребрикова сменила цель с CCR5 на GJB2, ей, во-первых, предстояло разобраться с вопросами, которые задавали к их предыдущей работе, а кроме того учесть еще и всплывшую проблему с потерей гетерозиготности.

Попытка #2: GJB2

Проект начался с подбора направляющей РНК и проверки ее на клетках соединительной ткани. Правда, об исправлении мутации 35delG пока речи не идет: у ученых даже нет подходящего материала для экспериментов. Вместо этого они пока пытаются сделать из «слышащих» клеток «тугоухие», то есть внести в ген GJB2 мутацию 35delG.

На этом этапе генетикам удалось подобрать РНК-гид, который приводил бы к разрезанию GJB2 с эффективностью, близкой к 100 процентам. С ним ученые перешли к эксперименту на зиготах.

Через пять дней после введения в зиготу редактирующего коктейля получившиеся бластоцисты отправляли на генетический анализ. Планировалось не только смотреть наличие мутации в GJB2, но и секвенировать возможные места офф-таргетов, смотреть наличие хромосомных перестроек и проверять большие участки вокруг места разреза, чтобы засечь потерю гетерозиготности. А для проверки мозаичности эмбрионов планировалось сравнить результаты секвенирования нескольких клеток эмбриона с данными по целой бластоцисте.

Как уточнил Кривой, в настоящее время усилия команды сосредоточены именно на развитии методов генетического анализа эмбрионов. В докладе он представил результаты так называемого CNV-анализа (copy number variation), который после секвенирования генома по представленности сигналов разных его областей позволяет оценить количество копий участков размером больше 50 нуклеотидов. Таким образом можно отследить делеции, которые встречаются только на одной хромосоме из двух.

1. Согласно первым результатам редактирования, внести изменения в ген GJB2 действительно можно довольно эффективно. Анализ нескольких эмбрионов показал, что небольшие делеции, соответствующие событию неспецифичного зашивания разреза, присутствуют как в отобранных клетках, так и в целой бластоцисте. Варианта гена дикого типа найдено не было, что указывает на отсутствие мозаичности.

   

   Поделиться
   
   
2. А вот заставить системы репарации использовать ДНК-заплатку пока не удалось — эффективность встройки оказалась крайне низкой.
   
3. CNV-анализ показал наличие куда большей проблемы — во всех эмбрионах пропала или одна копия 13-й хромосомы, или значительный ее фрагмент, содержащий ген GJB2. По словам Кривого, это связано с неудачно подобранной концентрацией компонентов коктейля в первом эксперименте, и во втором раунде редактирования этого удалось избежать. Тем не менее, этот факт показывает, что опасения экспертов по поводу неотработанности технологии возникают не на пустом месте.

   

   Поделиться
   
   
4. Проверки на офф-таргеты в новых экспериментах так же, как и при работе с CCR5, пока не проводилось.
   

Итого

После переключения с гена CCR5 на GJB2 дела у группы Ребрикова пока идут хуже:

• Добиться эффективного встраивания ДНК-заплатки пока не удалось, хотя в прошлом проекте этот механизм работал хорошо;

• возникла проблема с потерей 13-й хромосомы;

• проблему нецелевого редактирования ученые пока обходят молчанием.

Кривой говорит, что дальше группа будет заниматься подбором новых условий, менять концентрацию и химически модифицировать ДНК-заплатку, чтобы добиться увеличения эффективности ее встройки, а также займется анализом ДНК на офф-таргеты.

Если в прошлом проекте с CCR5 команда работала с известной моделью (причем, явно недостаточно проверяла полученные эмбрионы на предмет мутаций, чтобы говорить об успехе), редактировать ген GJB2 человека пока никто, кроме российских ученых, еще не пробовал (правда, в прошлом году китайцы вставили целый мутантный GJB2 человека в свинью).

По сути, команда еще в самом начале пути к терапевтическому редактированию глухоты, признается собеседник N + 1. Срок доведения системы до ума и проверку безопасности он оценивает в два года.

Впрочем, похоже, что торопиться им некуда — по словам Дениса Ребрикова, в настоящее время желающих отредактировать ребенка прямо сейчас у них нет, как нет и мутантных по GJB2 донорских яйцеклеток. Однако, нельзя сказать, что ученые работают впустую, — освоение тонкостей редактирования генома и полногеномного анализа ДНК, исследование «подводных камней» технологии никак нельзя назвать пустой тратой времени.