Мутации доменов связывания обоих белков приводят к аутовоспалительным заболеваниям
Три независимых научных группы, воспользовавшись разными подходами, обнаружили дополнительный путь активации пирина — белка инфламмасом, мутации в гене которого приводят к пирин-ассоциированным аутовоспалительным заболеваниям — среди них наиболее известна периодическая болезнь, или семейная средиземноморская лихорадка. Этот путь оказался связан с регулятором клеточного цикла CDC42, который связывается с С-концевым доменом пирина и активирует его наряду с известным RhoA-зависимым механизмом. Статьи (раз, два, три) и комментарий стороннего эксперта опубликованы в журнале Science Immunology.
Пирин, кодируемый геном MEFV, — связанный с цитоскелетом паттерн-распознающий рецептор, который распознает индуцированные патогенами нарушения сигнальных путей клетки. При активации пирин формирует пириновые инфламмасомы, которые состоят из него, связанного с апоптозом белка PYCARD, который взаимодействует с N-концевым доменом пирина PYD, и каспазы-1. Сборка инфламмасомы приводит к активации каспазы-1 и, как следствие, к созреванию интерлейкина-1β и интерлейкина-18 и расщеплению гасдермина D. Из-за этого в мембране клетки формируются поры, приводящие к пироптозу с высвобождением воспалительных цитокинов.
В состоянии покоя активная ГТФаза RhoA активирует киназы N1 и N2, которые фосфорилируют пирин, что обеспечивает его связывание с белками 14-3-3 и инактивацию. При инактивации RhoA бактериальными токсинами или другими стимулами происходит активация пирина и сборка инфламмасом. Мутации MEFV с приобретением функций снижают порог активации пирина и приводят к пирин-ассоциированным аутовоспалительным заболеваниям, включая периодическую болезнь. При этом многие такие мутации находятся в С-концевом домене пирина B30.2 с неизвестными функциями, который есть у человека и отсутствует у мыши.
Ёситака Хонда (Yoshitaka Honda) из Киотского университета и его коллеги из Германии и Японии проанализировали in vitro варианты MEFV из базы данных Infevers. С помощью клеточной пироптозной аналитической системы они охарактеризовали 265 миссенс-вариантов этого гена и идентифицировали прежде неизвестные патогенные варианты. Часть этих вариантов, которые обладали более сильными функциональными эффектами и были редкими в общей популяции, оказались локализованы в домене B30.2. Дальнейшие эксперименты с клеточными культурами показали, что пирин может активироваться и формировать агрегаты при ингибировании каспаз N1 и N2 (то есть по механизму, независимому от RhoA и домена PYD), и эта активация значительно усиливается при мутациях B30.2 с приобретением функций.
Этого не происходило при нокауте гена Rho ГТФазы CDC42, которая участвует в регуляции клеточного цикла и, как было показано ранее, способствует сборке пириновых инфламмасом. Авторы обнаружили что при мутации CDC42R186C, которая обеспечивает аберрантное пальмитоилирование этого белка и его связывание с аппаратом Гольджи, пирин также аккумулируется на аппарате Гольджи. Эксперименты с химерными и мутантными вариантами CDC42 подтвердили, что связанная с клеточными мембранами форма этого белка регулирует внутриклеточный транспорт пирина и стимулирует его агрегацию при формировании инфламмасом независимо от своей ГТФазной активности. Моделирование с использованием AlphaFold 3 определило связывающиеся друг с другом домены B30.2 пирина и CDC42 и роль мутаций в этом связывании.
Сет Мастерс (Seth Masters) из Университета Монаша и его коллеги из Австралии, Германии, США и Южной Кореи с помощью секвенирования экзома идентифицировали в трех поколениях семьи, члены которой страдали аутовоспалительным заболеванием, ранее неизвестный вариант CDC42M45L. Эксперименты с трансгенными клетками, экспрессирующими этот и другие варианты CDC42 с флуоресцентными белками, показали, что CDC42M45L обладает повышенной гидрофобной аффинностью к пирину и способствует активации пириновых инфламмасом. Используя усеченные варианты пирина, исследователи убедились, что CDC42 связывается с его доменом B30.2, и также промоделировали структуру этого связывания с помощью AlphaFold, показав критическую роль в нем метионина в 45 положении CDC42.
Жером Делон (Jérôme Delon) из Университета Париж-Сите и его коллеги из Австралии, Германии, Италии, Нидерландов, Франции и Японии воспользовались секвенированием методом Сэнгера и идентифицировали у шести пациентов с аутовоспалительным заболеванием из трех семей гетерозиготный вариант CDC42T43I. Он не влиял на внутриклеточную локализацию CDC42, но обеспечивал повышенную гидрофобную аффинность к пирину с усиленной активацией пириновых инфламмасом, причем механизмы этой активации отличались от пальмитоилирования при варианте CDC42R186C. Эксперименты по замене треонина в 43 положении CDC42 другими аминокислотами показали, что от него зависит степень активации пирина вне зависимости от локализации CDC42 в клетке. Моделирование с помощью AlphaFold указало на то, что обнаруженная у пациентов замена этой аминокислоты на изолейцин способствует связыванию с доменом B30.2 пирина за счет усиления ван-дер-ваальсовых взаимодействий, что потенциирует активацию пириновых инфламмасом и пироптоз.
В сумме полученные данные свидетельствуют о том, что CDC42 связывается с доменом B30.2 пирина и активирует его независимо от от RhoA и домена PYD, причем эти механизмы могут дополнять друг друга, усиливая агрегацию пирина и формирование инфламмасом. При этом мутации и домена B30.2 пирина, и связывающегося с ним домена CDC42, повышающие аффинность этих белков друг к другу, стимулируют формирование инфламмасом и пироптоз клеток, что приводит к развитию пирин-ассоциированных аутовоспалительных заболеваний.
Ранее американские, китайские и турецкие исследователи показали, что мутантные варианты пирина при периодической болезни предотвращают блокирование этого белка токсинами некоторых бактерий, в числе которых чумная палочка (Yersinia pestis). Таким образом, болезнь могла обеспечивать определенную степень защиты от инфекции, а эпидемии чумы могли помочь мутации закрепиться и распространиться в странах Средиземноморья.