Модификация гена фермента спасла мышей от осложнений инфаркта

Изменение структуры гена Са2+/кальмодулин—зависимой протеинкиназы IIδ в клетках сердечной мышцы мышей позволило защитить этот фермент от окислительной активации после острой ишемии. Это привело к сохранению кальциевого гомеостаза в клетках и устранило процессы воспаления, апоптоза и фиброза в миокарде. Результаты исследования опубликованы в журнале Science.

Ca2+/кальмодулин—зависимую протеинкиназу IIδ (CaMKIIδ) считают основным регулятором передачи сигналов в клетках сердца. Известно, что окисление двух остатков метионина в регуляторном домене этого фермента ведет к его чрезмерной активации. Она приводит к нарушению кальциевого гомеостаза клетки, воспалению и фиброзу, и, как следствие, к синдрому ишемии-реперфузии (он может развиваться после восстановления коронарного кровотока при инфаркте), гипертрофии миокарда и аритмиям.

Ранее ученые научились заменять остатки метионина валином, тем самым предотвратив гиперактивацию протеинкиназы. Однако сделать это получилось лишь в зародышевых линиях. Эрик Олсон (Eric Olson) из Юго-западного медицинского центра Техасского университета с коллегами искали способ предотвратить гиперактивацию CaMKIIδ у взрослых мышей, чтобы защитить их миокард от фиброза. Для этого они воспользовались системой CRISPR-Cas.

Ученые предположили, что с помощью редактирования адениновых оснований и замены двух кодирующих метионин кодонов на кодоны валина можно сделать CaMKIIδ нечувствительной к окислительной активации в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках человека.

Они разработали две гидовых РНК, одна из которых (sgRNA1) специфично редактировала лишь один остаток метионина, а вторая (sgRNA6) могла редактировать сразу оба кодона метионина. При этом вторая гидовая РНК редактировала и гомологичный ген CaMKIIβ, однако он не экспрессируется в клетках сердца.

Чтобы исследовать эффект редактирования гена, ученые сгенерировали три независимые гомозиготные линии плюрипотентных стволовых клеток человека — с sgRNA1, sgRNA6 и клетки дикого типа. Их дифференцировали в кардиомиоциты, которые подвергли ишемическому-реперфузионному повреждению. Ни в одной из линий количество протеинкиназы не изменилось после повреждения.

Однако в линии дикого типа ученые обнаружили активацию окисления фермента и существенное усиление аутофосфорилирования, в отредактированных линиях наблюдалась меньшая окислительная активность в отношении протеинкиназы и меньшая степень аутофосфорилирования. Также повреждение клеток дикого типа привело к увеличению диастолических уровней кальция и аритмии, в то же время отредактированные клетки не страдали от изменений гомеостаза кальция.

Две группы мышей подвергли операции на открытой грудной клетке, чтобы смоделировать ишемически-реперфузионное повреждение. До операции у всех мышей наблюдалась нормальная сердечная функция и сходные функциональные показатели на эхокардиографии. Ученые упаковали компоненты редактирующей системы с более эффективной sgRNA6 в аденоассоциированный вирус серотипа 9 и заразили им сердца мышей после операции в одной группе. Мышам из контрольной группы сделали инъекцию с пустым аденоассоциированным вирусом.

В течение первой недели сердечная функция оставалась стабильной в обеих группах, однако, начиная со второй недели, по данным эхокардиографии сердца исследуемых мышей начали функционально восстанавливаться. Такие сроки согласуются с данными о том, что редактирование генома начинается в течение недели после введения компонентов CRISPR-Cas in vivo.

В дальнейшем сердечная деятельность у исследуемых мышей продолжала восстанавливаться. Кроме того, через три недели у контрольных мышей ученые обнаружили дилатацию (расширение) левого желудочка — признак сердечной недостаточности. У мышей с отредактированным геномом ученые не обнаружили изменений в камерах сердца. Такую же картину изменений в сердце в обеих группах исследователи наблюдали при магнитно-резонансной томографии.

Молекулярные анализы сердечной ткани, которые ученые провели через пять недель после операции и введения редактирующей системы, показали, что оба метиониновых участка отсутствовали во всех кардиомиоцитах в области повреждения. При этом ученые не обнаружили нецелевого редактирования изоформ протеинкиназы и редактирования интересующей протеинкиназы в других органах — головном мозге, мышцах и печени. По-видимому, это связано с тем, что исследователи использовали в качестве промотора сердечный тропонин Т, чтобы придать тропность вирусу.

У мышей из контрольной группы анализ белка показал увеличение окисленной протеинкиназы в 4,4 раза; в кардиомиоцитах мышей с измененным геномом ученые не нашли значимого увеличения этого показателя. Кроме того степень аутофосфорилирования и активности протеинкиназы была значительно выше у контрольных мышей.

Ученые считают, что пациентам с инфарктом миокарда, которым внутрисосудисто проводят восстановление хирургическое лечение коронарных артерий, можно в момент операции вводить компоненты для редактирования гена CaMKIIδ для минимизации осложнений некроза и снижения риска развития сердечной недостаточности. Однако прежде чем начинать клинические испытания на людях, необходимы дальнейшие подробные доклинические испытания.

Попытки восстановить миокард после инфаркта с помощью воздействия на генетический аппарат клетки набирают обороты. Мы рассказывали, что американские исследователи разработали препарат на основе матричной РНК, который помог восстановить сердечную мышцу у мышей после обширного инфаркта.