Модификация гена фермента спасла мышей от осложнений инфаркта
В протеинкиназе заменили метионин на валин
Изменение структуры гена Са2+/кальмодулин—зависимой протеинкиназы IIδ в клетках сердечной мышцы мышей позволило защитить этот фермент от окислительной активации после острой ишемии. Это привело к сохранению кальциевого гомеостаза в клетках и устранило процессы воспаления, апоптоза и фиброза в миокарде. Результаты исследования опубликованы в журнале Science.
Ca2+/кальмодулин—зависимую протеинкиназу IIδ (CaMKIIδ) считают основным регулятором передачи сигналов в клетках сердца. Известно, что окисление двух остатков метионина в регуляторном домене этого фермента ведет к его чрезмерной активации. Она приводит к нарушению кальциевого гомеостаза клетки, воспалению и фиброзу, и, как следствие, к синдрому ишемии-реперфузии (он может развиваться после восстановления коронарного кровотока при инфаркте), гипертрофии миокарда и аритмиям.
Ранее ученые научились заменять остатки метионина валином, тем самым предотвратив гиперактивацию протеинкиназы. Однако сделать это получилось лишь в зародышевых линиях. Эрик Олсон (Eric Olson) из Юго-западного медицинского центра Техасского университета с коллегами искали способ предотвратить гиперактивацию CaMKIIδ у взрослых мышей, чтобы защитить их миокард от фиброза. Для этого они воспользовались системой CRISPR-Cas.
Ученые предположили, что с помощью редактирования адениновых оснований и замены двух кодирующих метионин кодонов на кодоны валина можно сделать CaMKIIδ нечувствительной к окислительной активации в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках человека.
Они разработали две гидовых РНК, одна из которых (sgRNA1) специфично редактировала лишь один остаток метионина, а вторая (sgRNA6) могла редактировать сразу оба кодона метионина. При этом вторая гидовая РНК редактировала и гомологичный ген CaMKIIβ, однако он не экспрессируется в клетках сердца.
Чтобы исследовать эффект редактирования гена, ученые сгенерировали три независимые гомозиготные линии плюрипотентных стволовых клеток человека — с sgRNA1, sgRNA6 и клетки дикого типа. Их дифференцировали в кардиомиоциты, которые подвергли ишемическому-реперфузионному повреждению. Ни в одной из линий количество протеинкиназы не изменилось после повреждения.
Однако в линии дикого типа ученые обнаружили активацию окисления фермента и существенное усиление аутофосфорилирования, в отредактированных линиях наблюдалась меньшая окислительная активность в отношении протеинкиназы и меньшая степень аутофосфорилирования. Также повреждение клеток дикого типа привело к увеличению диастолических уровней кальция и аритмии, в то же время отредактированные клетки не страдали от изменений гомеостаза кальция.
Две группы мышей подвергли операции на открытой грудной клетке, чтобы смоделировать ишемически-реперфузионное повреждение. До операции у всех мышей наблюдалась нормальная сердечная функция и сходные функциональные показатели на эхокардиографии. Ученые упаковали компоненты редактирующей системы с более эффективной sgRNA6 в аденоассоциированный вирус серотипа 9 и заразили им сердца мышей после операции в одной группе. Мышам из контрольной группы сделали инъекцию с пустым аденоассоциированным вирусом.
В течение первой недели сердечная функция оставалась стабильной в обеих группах, однако, начиная со второй недели, по данным эхокардиографии сердца исследуемых мышей начали функционально восстанавливаться. Такие сроки согласуются с данными о том, что редактирование генома начинается в течение недели после введения компонентов CRISPR-Cas in vivo.
В дальнейшем сердечная деятельность у исследуемых мышей продолжала восстанавливаться. Кроме того, через три недели у контрольных мышей ученые обнаружили дилатацию (расширение) левого желудочка — признак сердечной недостаточности. У мышей с отредактированным геномом ученые не обнаружили изменений в камерах сердца. Такую же картину изменений в сердце в обеих группах исследователи наблюдали при магнитно-резонансной томографии.
Молекулярные анализы сердечной ткани, которые ученые провели через пять недель после операции и введения редактирующей системы, показали, что оба метиониновых участка отсутствовали во всех кардиомиоцитах в области повреждения. При этом ученые не обнаружили нецелевого редактирования изоформ протеинкиназы и редактирования интересующей протеинкиназы в других органах — головном мозге, мышцах и печени. По-видимому, это связано с тем, что исследователи использовали в качестве промотора сердечный тропонин Т, чтобы придать тропность вирусу.
У мышей из контрольной группы анализ белка показал увеличение окисленной протеинкиназы в 4,4 раза; в кардиомиоцитах мышей с измененным геномом ученые не нашли значимого увеличения этого показателя. Кроме того степень аутофосфорилирования и активности протеинкиназы была значительно выше у контрольных мышей.
Ученые считают, что пациентам с инфарктом миокарда, которым внутрисосудисто проводят восстановление хирургическое лечение коронарных артерий, можно в момент операции вводить компоненты для редактирования гена CaMKIIδ для минимизации осложнений некроза и снижения риска развития сердечной недостаточности. Однако прежде чем начинать клинические испытания на людях, необходимы дальнейшие подробные доклинические испытания.
Попытки восстановить миокард после инфаркта с помощью воздействия на генетический аппарат клетки набирают обороты. Мы рассказывали, что американские исследователи разработали препарат на основе матричной РНК, который помог восстановить сердечную мышцу у мышей после обширного инфаркта.
Это произошло после формирования нейронной связи между клетками циркадных часов и Dh44-нейронами
Биологи определили момент, в который циркадные часы начинают управлять циклами сна и бодрствования у личинок плодовых мушек. Оказалось, это происходит в начале третьего дня развития под влиянием новой связи между нейронами циркадных часов и клетками Dh44, которые контролируют бодрствование личинок. Кроме того, после формирования этой связи у личинок появилась долгосрочная память. Исследование опубликовано в журнале Science Advances. Циркадные ритмы у многих видов формируются еще на самых ранних этапах развития. Так, например, у млекопитающих клетки супрахиазматического ядра детеныша синхронизируют свою ритмическую активность еще во время беременности. Однако многие матери новорожденных могут подтвердить, что дети в этом возрасте редко спят ночью и бодрствуют днем — в основном их сон равномерно распределен по суткам. Исследования подтверждают, что циклы сна и бодрствования у младенцев чаще всего появляются от трех до двенадцати месяцев. До сих пор не было понятно, почему, несмотря на работу клеток циркадных часов, циклы сна и бодрствования формируются довольно поздно и как этот процесс влияет на другие функции мозга — например, долговременную память. Исследователи из университета Пенсильвании под руководством Эми По (Amy R. Poe) изучили аналогичный процесс на дрозофилах. Биологи отследили момент, в который у личинок мушек появляются циклы сна и бодрствования — это произошло в начале третьего дня развития. Чтобы понять, что именно происходит с циркадными ритмами в этот момент, исследователи изучили активность нейронов мозга у личинок. Прежде всего они проверили нейроны, которые производят нейропептид Dh44, поскольку они расположены в области циркадных часов у взрослых мушек.Для этого они создали трансгенных насекомых, у которых эти клетки синтезировали теплочувствительный ионный канал. Таким образом, когда личинок помещали в теплую среду, в Dh44-нейронах начинался ионный ток и те активировались. Оказалось, что эти клетки действительно участвуют в регуляции циклов сна: после их активации личинки на второй стадии меньше спали в течение суток (p < 0,0001). Тогда исследователи решили изучить, как активность этих клеток меняется при переходе со второй стадии личинок на третью — в момент появления ритмов сна. Оказалось, активность Dh44 не отличается на первой и второй стадии, но снижается в начале третьей. Это согласовывалось и с повышенным количеством сна у личинок в этот день: активность нейронов снизилась и они перестали оказывать свое бодрящее действие на личинок. Биологи предположили, что в этот момент Dh44-нейроны связываются с клетками, которые задают общий циркадный ритм организму мушек. Для этого они отследили нейронные связи этого мозгового центра. И действительно, при переходе со второй стадии на третью Dh44-нейроны сформировали связь с одной из клеток часов — DN1a. Ученые также подтвердили, что активация DN1a действительно «включает» Dh44 и увеличивает длительность бодрствования у личинок. Тогда исследователи решили проверить, как появление связи циркадных ритмов с циклами сна и бодрствования влияет на другие процессы в мозге насекомых. Зная, что переход памяти из кратковременной в долговременную происходят во время сна, биологи протестировали оба типа памяти у животных. Для этого они использовали стандартный для таких задач тест — проверяли, как личинки запоминают отвратительные запахи. И на второй, и на третьей стадии личинки одинаково хорошо проходили тесты на кратковременную память, а вот долговременная память появилась лишь при переходе между ними. При этом активация Dh44-нейронов, которые снижали количество сна у личинок, нарушала процессы долговременной памяти. Так, биологи не только в подробностях описали, как клетки циркадного ритма начинают контролировать циклы сна и бодрствования, но и показали, что этот процесс очень важен для развития таких сложных когнитивных функций как долговременная память. Сон и память действительно тесно связаны — депривация сна способна даже стирать воспоминания. Недавно мы писали об исследовании, в котором такие воспоминания удалось восстановить у мышей.
