Швейцарские ученые предложили и отработали метод, позволяющий расшифровать
транскриптом отдельных клеток, не убивая их. Для этого они проводили биопсию цитоплазмы и секвенировали полученный генетический материал. Ученые использовали эту методику для того, чтобы разделить разные типы морфологически схожих клеток
и описать изменение экспрессии множества генов в ответ на кратковременную или продолжительную
стимуляцию. Статья опубликована в Nature.
Исследование экспрессии генов критически важно для понимания принципов их функционирования. Один из способов, позволяющих оценить экспрессию многих генов единовременно — методика секвенирования РНК одной клетки (scРНК-секвенирвание). Технология была отработана уже ко второй половине двухтысячных годов, а в 2013 году Nature Methods признал секвенирование одной клетки методом года. Порог чувствительности современных технологий позволяет секвенировать транскриптом отдельной клетки, оперируя лишь пикограммовыми количествами нуклеиновой кислоты, а доступные сегодня методы высокопроизводительного секвенирования (NGS) позволяют делать это с высокой точностью и за относительно небольшое время.
Проблема в том, что секвенированию должно предшествовать выделение нуклеиновой кислоты из биоматериала. Поскольку стандартная технология выделения нуклеиновых кислот подразумевает разрушение (лизис) клеток, то при таком подходе невозможно оценивать экспрессию генов в одной клетке на протяжении времени.
Биотехнологи из Швейцарского федерального института технологии в Лозанне под руководством Барта Депланке (Bart Deplancke) применили оригинальный подход к выделению РНК из клеток и секвенированию РНК одной клетки. Вместо лизиса они предложили выполнять биопсию цитоплазмы интересующих клеток. Саму технологию выделения РНК из цитоплазмы коллектив описал еще в 2016 году, но только сейчас ее отработали для применения в реальном эксперименте для описания транскриптома живых клеток. Доработанный метод получил название Live-seq.
Методика состоит из нескольких этапов. Сначала с помощью разработанного в этой лаборатории зонда с внутренним диаметром канала 800 нанометров забирали часть цитоплазмы (0,7–3,5 пиколитра, то есть, в зависимости от клеточной культуры, 40–70 процентов общего объема цитоплазмы клетки) под контролем световой микроскопии. По заявлению авторского коллектива статьи, на подготовку и выполнение биопсии у опытного оператора уходит около 15 минут. Выживаемость клеток после процедуры составила 85–88 процентов, и клетки восстанавливали свой объем за 100-320 минут. 294 биопсии из проведенной 641 оказались успешными. По расчетам исследователей, выход РНК при биопсии цитоплазмы составляет от субпикограммовых количеств до нескольких десятков пикограммов.
Из цитоплазматическй РНК затем получали комплементарную ДНК при помощи обратной транскрипции. Затем следовали 11 циклов ПЦР для наработки генетического материала, и, наконец, высокопроизводительное секвенирование. На основе полученных данных описывали транскриптом образца (с визуализацией на основе алгоритма tSNE).
Чтобы приложить методику Live-seq к реальной задаче, авторы решили отдифференцировать с ее помощью разные клеточные типы между собой. За основу взяли три мышиных клеточных линии: иммортализованные предшественники бурой жировой ткани (IBA), первичные предшественники жировой ткани (ASPC) и макрофаги, происходящие от клеточной линии RAW264.7. Клетки всех линий по форме были близки к сферической, что упростило биопсию и расчет клеточных объемов.
В геном RAW был встроен красный флуоресцентный белок mCherry, активность которого контролировал промотор Tnf, и синий флуоресцентный белок, активируемый промотором Nfkbia (активирован при «включении» сигнального пути NF-kB). Чтобы протестировать методику в оценке ответа макрофагов на стимуляцию, исследователи проводили первую биопсию цитоплазмы, а спустя 0,5–1,5 часа культуры клеток обрабатывали раствором липополисахарида; через 4–5 часов проводили повторную биопсию. До и после биопсии проводили записывали таймлапс клеток, чтобы по покраснению цитоплазмы зарегистрировать экспрессию mCherry. Таким образом, на примере RAW моделировалась острая активация врожденного иммунитета.
На клетках ASPC ученые проверяли изменение транскриптома в ответ на сигнал о дифференцировке. Клетки подвергали биопсии, после чего инкубировали на среде, содержащей смесь веществ, запускающих дифференцировку в адипоциты (розиглитазон, инсулин). Через два дня авторы делали повторную биопсию цитоплазмы, и еще через пять дней заканчивали эксперимент (при этом проводили окрашивание клеток на липиды).
В трех клеточных линиях при помощи Live-seq исследователи в совокупности обнаружили экспрессию более чем 4100 генов при глубине покрытия около одного миллиона прочтений на образец.
При повторной биопсии цитоплазмы RAW было обнаружено, что параллельно с появлением окрашивания mCherry в макрофагах (она нарастала спустя пять часов после обработки) поменялся профиль экспрессии генов. В ASPC через два дня тоже обнаружили изменение транскриптома, а еще через пять дней было подтверждено накопление липидных капель, что характерно для дифференцировки клеток-предшественников в адипоциты.
Для оценки эффективности метода параллельно провели scРНК-секвенирование 573 клеток. Авторы статьи признают, что секвенирование РНК из мертвой клетки оказалось гораздо чувствительнее: более 8,3 тысячи генов при глубине 70 тысяч последовательностей на образец. Около 80 процентов от всех дифференциально экспрессируемых генов были выявлены при помощи секвенирования «мертвой» клетки. При этом информативными оказались более 96 процентов проб.
Чтобы проверить, не связаны ли выявленные изменения транскриптомов с биопсией цитоплазмы, исследователи дополнительно провели биопсию цитоплазмы без стимуляции клеток. Спустя час или через четыре часа проводили scРНК-секвенирование этих клеток. В результате было обнаружено лишь 12 генов, экспрессия которых меняется после бипсии цитоплазмы (в том числе показатели клеточного стресса, такие как III фактор коагуляции и поли-АДФ-рибозо-полимераза, и ряд белков внутриклеточного сигналинга).
Таким образом, предложенный метод секвенирования транскриптома одной живой клетки показал как плюсы, так и минусы. С одной стороны, методика позволяет отследить изменение транскриптома в ответ на обработку отдельных клеток лекарствами, ядами, цитокинами или питательными веществами, изменение условий содержания или отслеживать напрямую эффекты геномного редактирования и его последствия. По заявлениям авторов, метод воспроизводим, а доля погибающих во время процедуры клеток относительно невелика. Сама биопсия цитоплазмы, по всей видимости, мало влияет на транскриптом.
С другой стороны, методика пока еще обладает довольно низкой чувствительностью: многие матричные РНК встречаются в клетках в штучных количествах, что повышает вероятность ложно-отрицательных результатов, что бросается в глаза при сопоставлении с scРНК-секвенированием. Неизвестно, как перенесут клетки более двух биопсий, и как меняется концентрация РНК и чувствительность секвенирования при каждой последующей биопсии. Однако каждая новая геномная технология, несомненно, способствует лучшему пониманию молекулярных основ функционирования клетки.
Недавно мы рассказывали о секвенировании транскриптома одной клетки применительно к другой задаче — оценке того, как меняется профиль экспрессии генов в клетках эмбриона от трех родителей (после экстракорпорального оплодотворения в сочетании с трансплантацией митохондрий). Кроме того, в один день со статьей швейцарских ученых в Nature Genetics опубликовали исследование о том, что большинство индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в процессе инкубации на среде приобретают большой мутационный груз — пример проблемы, в изучении которой была бы полезна подобная технология.
Сергей Задворьев