Биоинженеры из Университета штата Вашингтон разработали электрохимический метод, который позволит быстро определить резистентность бактерий к антибиотикам. С помощью системы, которая состоит из электрода и вещества-медиатора и измеряет эффективность клеточного дыхания, тест можно будет провести за полтора часа. Статья опубликована в журнале Biosensors and Bioelectronics.
При лечении бактериальных инфекций могут возникнуть ситуации, когда нужно оценить чувствительность возбудителя к препарату — например если пациенту назначают повторный курс антибиотиков. При проведении теста на резистентность обычно оценивают скорость роста бактериальной культуры под воздействием того или иного антибиотика. Такое исследование занимает два–три дня, на протяжении которых пациент получает вероятно неэффективное лекарство. Это создает благоприятные условия для отбора отдельных устойчивых к антибиотикам бактерий, что приводит к появлению новых резистентных штаммов.
Чтобы ускорить анализ, используют альтернативный метод, основанный на измерении эффективности клеточного дыхания. При дыхании происходит перенос электронов между белками дыхательной цепи, расположенными на мембране бактериальной клетки, — и эти электроны способны создавать электрический ток, который можно зарегистрировать с помощью электрода. Такой метод занимает меньше времени, чем выращивание бактерий в чашках Петри, но используется мало, так как не все бактерии способны переносить электроны напрямую на электрод.
Группа биоинженеров из Университета штата Вашингтон во главе с Гретхен Тиббитс (Gretchen Tibbitts) представила усовершенствованный электрохимический метод определения устойчивости к антибиотикам. Проблема существующего метода заключалась в том, что электроны могут переноситься на электрод только в присутствии вещества-медиатора, способного восстанавливаться, а затем окисляться, а выделять такие вещества во внешнюю среду большинство бактерий не могут. Эту проблему биоинженеры решили добавлением в систему феназинметосульфата, который используется для проведения теста на жизнеспособность клеток (MTS-теста). В данном исследовании он применялся не для проведения MTS-теста, а именно в качестве переносчика электронов. Усовершенствованный метод назвали READAS (Rapid Electrochemical Assay for Detecting Antibiotic Susceptibility).
Для определения устойчивости к антибиотикам ученые взяли различные — чувствительные и устойчивые к антибиотикам — штаммы четырех видов патогенных бактерий: Acinetobacter baumannii, Staphylococcus aureus, Escherichia coli и Klebsiella pneumoniae. Первые два вида вызывают широкий спектр заболеваний человека, от кожных воспалений до менингита. E. coli — часть нормальной микрофлоры кишечника, но некоторые патогенные штаммы могут вызывать кишечные инфекции. K. pneumoniae — возбудитель пневмонии, а также некоторых урогенитальных инфекций. На этих бактериях исследователи протестировали четыре антибиотика с различными механизмами действия: тобрамицин (ингибирует синтез белка), ципрофлоксацин (нарушает транскрипцию), а также имипенем и оксациллин (ингибируют синтез клеточной стенки).
Жизнеспособность клеток оценивали по силе тока, которая снижается, если бактерия чувствительна к антибиотику, и не меняется или меняется незначительно, если штамм является резистентным. Ни одно из измерений не заняло больше 90 минут. Чтобы классифицировать результаты теста ученые ввели величину, которую назвали индексом чувствительности к антибиотику. Если индекс больше 0,4, то штамм считают чувствительным к антибиотику, а если меньше — резистентным.
Биоинженеры надеются, что усовершенствованный ими метод вскоре будут применять в медицинских исследованиях. Полностью отойти от привычного сценария с культивированием бактерий вряд ли удастся, но сокращение срока проверки на резистентность — несомненное преимущество, так как это позволит пациентам раньше получать эффективное лечение, а также ослабит положительный отбор устойчивых к антибиотикам особей.
Резистентные бактерии представляют настоящую угрозу современной медицине. Инфекции, вызванные такими штаммами, тяжело поддаются лечению, а иногда и вовсе не лечатся. Сейчас проблему резистентности пытаются решить поиском новых антибиотиков и использованием бактериофагов — вирусов, поражающих бактерии. Например, недавно мы писали о попытке применить бактериофаги для лечения муковисцидоза.
Наталья Кондратенко
Это облегчило симптомы поражения мышц и нервов
Выращивание дрозофил с дефектом первого комплекса дыхательной цепи в среде с комбинацией 5-аминолевулиновой кислоты, гидрохлорида и железа натрия цитрата (5-ALA-HCl + SFC) увеличивает выработку АТФ за счет повышения активности второго и четвертого дыхательных комплексов. Активность первого комплекса при этом не меняется. Кроме того, у дрозофил снижалось накопление лактата и пирувата, которое происходит при дефекте первого комплекса, что, по-видимому, облегчало симптомы поражения мышц и нервов. Исследование опубликовано в Human Molecular Genetics. В митохондриях происходит окислительное фосфорилирование — многоэтапный процесс, в ходе которого окисляются восстановительные эквиваленты — восстановленные никотинамидадениндинуклеотид (НАДН) и флавинадениндинуклеотид (ФАДН2), — и вырабатывается АТФ. Происходит последовательный перенос электронов по дыхательной цепи — группе дыхательных ферментов в мембране митохондрии. Всего в цепи участвует пять комплексов дыхательных ферментов. Нарушение переноса электронов по дыхательной цепи сопровождается снижением выработки АТФ и вызывает митохондриальные заболевания. Наиболее часто «ломается» первый комплекс — НАДН-КоQ-оксидоредуктаза, или НАДН-дегидрогеназа. Его дефицит поражает органы и ткани с высокими энергетическими потребностями, таких как мозг, сердце, печень и скелетные мышцы. Обычно это проявляется тяжелыми неврологическими синдромами: например, наследственная оптическая нейропатия Лебера, синдром MELAS или синдром MERRF. Хотя первый комплекс отвечает за поступление наибольшего количества электронов в дыхательную цепь, второй комплекс — ФАД-зависимые дегидрогеназы, — работая параллельно с первым, также отвечает за вход электронов в цепь, передавая их, как и первый комплекс на убихинон (коэнзим Q). Потенциально повышение активности второго комплекса могло бы нивелировать снижение активности первого. Поскольку второй, третий и четвертый дыхательные комплексы и цитохром с содержат гемовые структуры, команда ученых под руководством Канаэ Андо (Kanae Ando) из Токийского столичного университета решили проверить, насколько эффективно будет применение предшественника гема 5-аминолевулиновой кислоты для повышения активности этих комплексов и восстановления синтеза АТФ у дрозофил с дефектом первого комплекса. Сначала ученые отключили у дрозофил ген, гомологичный NDUFAF6 и ответственный за экспрессию одного из регуляторных белков первого комплекса. У таких дрозофил мышцы были тоньше, хрупче и иннервировались хуже, чем у насекомых без нокдауна гена. Кроме того, самцы с неработающим геном погибали намного быстрее самок, и у них развивались более грубые нарушения опорно-двигательного аппарата. Затем ученые проанализировали как нокдаун гена первого комплекса влияет на экспрессию и активность других комплексов. Выяснилось, что нокдаун увеличивает экспрессию генов третьего и пятого комплексов, и снижает — четвертого. При этом активность второго и четвертого комплекса значительно повышалась после нокдауна у самок дрозофил. Ученые не обнаружили нарушений в процессах утилизации активных форм кислорода, однако у дрозофил обоих полов без работающего гена первого комплекса накапливался лактат и пируват. Чтобы проверить влияние комплекса 5-аминолевулиновой кислоты, гидрохлорида и железа натрия цитрата (5-ALA-HCl + SFC) на митохондрии дрозофил с нокаутированным геном, их выращивали в среде, содержащей этот комплекс. Такое воздействие значительно повышало уровни АТФ у самцов и самок дрозофил, при этом количество копий митохондриальной ДНК не изменялось, то есть препарат не увеличивал количество митохондрий. Экспрессия и активность дефектного первого комплекса никак не изменились, а активность второго и четвертого комплексов выросли у самцов. В целом, повышенная экспрессия генов третьего комплекса и активность второго и четвертого комплексов смягчали дефектные фенотипы. Помимо этого 5-ALA-HCl + SFC снижало накопление лактата и пирувата у самцов и самок с нокдауном гена первого комплекса, что потенциально смягчает метаболические нарушения, вызванные дефицитом первого комплекса. У самцов и самок мух-дрозофил, которых лечили 5-ALA-HCl + SFC, наблюдалось меньше дефектов опорно-двигательного аппарата, а продолжительность их жизни значительно увеличилась. Ученые рассчитывают проверить эффект такого лечения на животных с более сложным строением, чтобы подтвердить универсальность такого подхода к лечению митохондриальных нарушений. Не всегда нужна мутация, чтобы нарушить работу дыхательной цепи. Недавно мы рассказывали про то, что большое количество натрия из потребляемой соли нарушает дыхательную цепь митохондрий в регуляторных Т-лимфоцитах. Это приводит к активации аутоиммунных процессов.