Магнитное поле отделило живые клетки от мертвых
Американские ученые предложили сортировать мертвые и живые клетки с помощью магнитного поля: клетки протекают через небольшой канал между магнитами и оказываются на разной высоте за счет разной плотности. Исследователи провели неразрушающее разделение на раковых клетках молочной железы с разными концентрациями клеток — сортировка проходила всего за полчаса. Препринт работы опубликован на сайте biorxiv.org.
Для токсикологических исследований и трансплантации кроветворных стволовых клеток требуется отделить живые клетки от мертвых. На сегодняшний день ученые сортируют клетки с помощью окрашивающих меток, но, к сожалению, окрашивающие агенты значительно влияют на жизнеспособность клеток, а центрифугирование может повредить некоторым клеткам (например, лейкоцитам). Альтернативные методы (микрофильтрация, акустофорез и диэлектрофорез) более эффективны в стоимости, хоть и теряют в селективности. Поэтому биологи ищут недорогой, неразрушающий и безметочный метод.
Эллиот Чин (Elliot K. Chin) и Колин Грант (Colin A. Grant) продолжили исследования магнитной левитации одной клетки и предложили использовать ее для разделения живых и мертвых клеток. Для этого ученые запускали поток живых и мертвых клеток через микрофлюидный канал с двумя магнитами, которые перераспределяли клетки по плотности (у живых клеток плотность меньше, чем у мертвых).
Исследователи назвали свое устройство CelLEVITAS, подразумевая, что клетки в таком микрофлюидном канале левитируют под воздействием магнитного поля. Движущая сила распределения клеток по высоте канала — разница в магнитной восприимчивости между клеткой и парамагнитной окружающей средой, в роли которой выступает гадобутрол — нетоксичный хелатный комплекс, содержащий ион гадолиния, который применяется в качестве контрастного агента для МРТ. Это заставляет клетку двигаться от границ магнитов к середине канала, где магнитное поле минимально. Однако на клетку еще воздействуют гравитация и сила Архимеда, а потому положение равновесия трех сил смещается относительно центра канала. Такая система значительно снижает время сортировки живых и мертвых клеток до одной стадии в 30 минут.
Когда клетка умирает, она изменяется в размерах и, соответственно, плотности. В качестве проверки сортировки по плотности в магнитном поле ученые провели испытания без потока жидкости. Для проверки сортировки они смешали живые и мертвые раковые клетки молочной железы, которые предварительно окрасили: живые клетки с помощью кальцеина-АМ в зеленый, а мертвые с помощью йодида пропидиума в красный. Затем клеточную смесь поместили в парамагнитную среду, в которой за 15 минут живые и мертвые клетки установились на определенных высотах в зависимости от концентрации парамагнитной жидкой среды. Наилучшее разделение клеток происходило при концентрации в 50 миллимоль, при котором между живыми и мертвыми клетками было 235,9 микрометра.
Затем исследователи пронаблюдали за процессом сортировки в реальном времени: окрашенная смесь клеток находилась между магнитами в течение 30 минут, при этом каждую минуту производилась съемка. Ученые обнаружили, что живые клетки быстро разместились на своей высоте за десять минут, в то время как мертвые клетки медленно перемещались на дно канала в течение всего времени выдержки.
Чтобы продемонстрировать применение CelLEVITAS для обогащения живых клеток, ученые внесли в поток смесь клеток, которая после прохождения через магнитный участок распределялась по двум выводящим каналам. Сортировка успешно проходила и при малых концентрациях клеток (50-100 клеток на миллилитр), так и при больших (200 тысяч клеток на миллилитр), а также при разных соотношениях мертвых и живых клеток (от 10 до 50 процентов живых клеток в смеси). Количество живых клеток в соответствующем выходном канале было приблизительно одинаковым для любых соотношений — около 75 процентов.
Авторы надеются, что с помощью такой технологии можно будет разделять хрупкие клетки, как например: макрофаги, адипоциты, кардимиоциты и Шванновские клетки, а также выделять редкие клеточные линии гораздо дешевле нынешних методов. В будущих работах они планируют использовать технологию CelLEVITAS для оценки чувствительности раковых клеток к лекарствам — в реальном времени можно будет определить чувствительные и резистентные клеточные популяции.
Сортировку можно проводить не только между мертвыми и живыми клетками. Год назад немецкие физики разработали микрофлюидный прибор для сортировки клеток по жесткости, основанном на детерминированном боковом смещении. С таким устройством можно будет разделять здоровые и больные эритроциты.
Артем Моськин
Ее произвели макрофаги в верхнем шейном нервном узле
Немецкие и американские исследователи пришли к выводу, что расстройства сна при хронических заболеваниях сердца связаны с нарушением симпатической иннервации шишковидного тела, вырабатывающей мелатонин, связанными с сердцем провоспалительными иммунными клетками. Публикация об этом появилась в журнале Science. У людей и других млекопитающих смену периодов сна и бодрствования контролирует секреция мелатонина, синхронизированная с 24-часовым циклом смены дня и ночи на Земле. Этот гормон вырабатывает шишковидное тело (эпифиз), расположенное в надталамической области головного мозга, в ответ на уровень симпатической иннервации из верхнего шейного узла. Помимо эпифиза и некоторых других органов этот узел иннервирует и сердце. Известно, что при хронических сердечных заболеваниях зачастую снижается уровень мелатонина и возникают сопутствующие нарушения сна, которые негативно сказываются на течении болезни и качестве жизни пациента. Механизмы этого явления изучены не были, при этом они могли бы дать почву для разработки новых методов лечения. Чтобы разобраться в этом вопросе, сотрудники различных научных центров Германии и США под руководством Штефана Энгельхардта (Stefan Engelhardt) из Мюнхенского технологического института изучили посмертные препараты эпифизов семи человек с кардиологическими заболеваниями и девяти без них. Оказалось, что при болезнях сердца значительно снижена плотность аксонов (то есть иннервация) в этой железе. Выяснив это, авторы работы перешли к экспериментам на мышах с двумя искусственно вызванными заболеваниями сердца: перегрузкой левого желудочка давлением путем хирургического сужения аорты и сердечной недостаточностью с сохранной фракцией выброса. Уровень мелатонина у таких животных был снижен, что сопровождалось нарушениями циркадианных ритмов. Генетическая маркировка помогла выявить у них резкое снижение симпатической иннервации эпифиза без нарушения его внутренней структуры и анатомического окружения. Морфометрическое и гистологическое исследование верхнего шейного узла продемонстрировало его значительную гипертрофию с замещением фиброзной соединительной тканью, что свидетельствует о тяжелом, возможно необратимом повреждении органа. Аналогичные изменения исследователи увидели на посмертных препаратах верхних шейных узлов кардиологических пациентов — рубцовая ткань замещала до 70 процентов их объема. При этом степень поражения узла значительно коррелировала со степенью ремоделирования миокарда в результате заболевания. Это подтвердили у живых пациентов с помощью УЗИ, а также обнаружили у них связь размеров верхнего шейного узла с фракцией выброса (функциональным показателем сердечной деятельности). После этого авторы работы выполнили секвенирование РНК одиночных клеток и ядер верхнего шейного узла мышей с кардиологическими заболеваниями, а также иммуногистохимическое окрашивание разных пулов его клеток и нервных связей с эпифизом. Выяснилось, что симпатическая иннервация железы значительно снижалась еще до декомпенсации сердечной недостаточности, и что при этом узел инфильтрирован провоспалительными макрофагами. В нервных узлах, не иннервирующих сердце, подобной инфильтрации не наблюдалось, уровни биомаркеров общего воспаления повышены не были, что свидетельствует о связи этих макрофагов именно с заболеванием сердца. Схожую картину удалось пронаблюдать и в посмертных образцах кардиологических пациентов. Транскриптомное профилирование межклеточных взаимодействий в верхнем шейном узле мышей на ранних стадиях болезни сердца показало, что сильнее всего нарушены связи между макрофагами и симпатическими нейронами, иннервирующими шишковидное тело. Еженедельные инъекции ингибитора макрофагов клодроната в этот узел сразу после операции по сужению аорты предотвращали денервацию железы и снижение уровня мелатонина. Эксперименты по совместному выращиванию клеток на питательной среде, подтвердили, что центральную роль в гибели симпатических нейронов играют активированные провоспалительные макрофаги. В 2020 году французские ученые обнаружили, что если люди засыпают позже привычного времени, то во время сна и на следующий день пульс у них значительно превышает норму. То же происходит и при засыпании на более чем полчаса раньше обычного, однако пульс при этом возвращается к норме уже через несколько часов сна. Годом позже британские исследователи показали, что с наименьшим риском сердечно-сосудистых заболеваний связан отход ко сну между 22 и 23 часами.