Кишечную палочку перевели на питание метанолом
Тайваньские ученые вывели штамм кишечной палочки (Escherichia coli), способный использовать метанол в качестве единственного источника пищи, сообщается в Cell. Скорость размножения таких бактерий значимо не отличалась от скорости размножения видов, которые изначально были метилотрофами: количество питающихся метанолом кишечных палочек удваивалось каждые 8,5 часа. Также исследователи обнаружили проблему, которая возникает из-за метаболизма метанола (химическое связывание ДНК с определенными белками), которую микроорганизмы частично решили увеличением числа копий определенных генов.
Чтобы поддерживать различные биохимические процессы в организме и обновлять структуры в его составе, всему живому необходимо питаться — получать энергию, углерод и электроны. В зависимости от того, какими источниками пищи пользуется вид, его относят к разным категориям «-трофов» («питающихся» по-древнегречески). К примеру, среди бактерий существуют метилотрофы — те, кто получает углерод и электроны из производных метана CH4, но не из него самого. Однако их не очень много.
Меж тем метанол (CH3OH) — соединение, способное служить хорошим источником электронов для микроорганизмов. Кроме того, его легко получить из парниковых газов — CO2 и метана. Если бы получилось создать легко разводимых бактерий, которые могут перерабатывать метанол, удалось бы снизить выбросы этих газов в атмосферу.
Попытки вывести метилотрофов уже предпринимали с кишечной палочкой (Escherichia coli) — самым популярным модельным объектом-прокариотом. Для этого разные коллективы микробиологов определяли, какие ферменты позволят бактериям перерабатывать CH3OH и какими генами эти ферменты кодируются. Также выявляли, какие методики культивирования лучше использовать, чтобы максимально эффективно выращивать нужные бактерии. Однако штаммов кишечной палочки, которые были бы способны использовать метанол в качестве единственного источника питания, пока не создали.
Теперь сотрудники Института биологической химии Академии Синика (Тайвань) под руководством Джеймса Ляо (James C. Liao) сумели добиться того, чтобы E. coli выживала и с приемлемой скоростью размножалась на одном лишь метаноле. Для этого они постепенно, не за одно поколение, заменяли бактериям гены ферментов, участвующих в пентозофосфатном цикле, на такие, которые позволяют перерабатывать метанол (новые гены «брали» из метилотрофов). Предварительно авторы смоделировали, какие гены и в какой последовательности надо будет менять, но, естественно, учитывали и данные реальных экспериментов по мере их проведения.
Первые модифицированные бактерии могли расти на среде, содержащей метанол и сахар ксилозу. Они пока не могли питаться одним лишь метанолом, но и не были в состоянии жить только на одной ксилозе. Это создало эволюционное давление, в ходе которого в популяции закреплялись гены, позволяющие перерабатывать метанол. Затем E. coli заменяли и другие участки ДНК, за счет чего находили оптимальный уровень экспрессии генов, нужных для метаболизма CH3OH. Дело в том, что при его переработке образуется токсичный формальдегид, который нужно успевать нейтрализовать. Состав питательной среды тоже меняли так, что в конечном счете в ней остался только метанол.
Авторы следили за генетическими изменениями в каждой колонии бактерий, а также за ростом численности кишечных палочек. Хотя самые успешные штаммы метилотрофов размножались довольно быстро, в ряде случаев процесс затягивался и до 11 процентов клеток в колонии оказывались мертвы. Исследуя ДНК этих микроорганизмов, ученые выяснили, что рост колоний задерживается из-за того, что у «синтетических» метилотрофов эта молекула часто химически связывается с различными белками, и этот патологический процесс провоцирует формальдегид.
Частично защищаться от связывания ДНК с белками бактериям удавалось за счет вариаций числа копий определенного участка генома размером 70 тысяч пар оснований (этот параметр стал меняться сам, без активных действий со стороны ученых). На этом участке находятся гены, регулирующие выработку и переработку формальдегида. Наиболее успешный штамм из «синтетических» метилотрофов мог выживать при концентрации метанола 1,2 моля на литр. Число клеток у него при питании метанолом могло удваиваться за 8,5 часа, что сопоставимо с возможностями «природных» представителей этой группы — Methylobacterium extorquens (от 4 до 6 часов в зависимости от штамма) и грибов Pichia pastoris (8,2 часа).
Исследование тайваньских ученых показало, что хотя сменить источник электронов и углерода у бактерий и сложно, но возможно. В дальнейшем можно будет создать штаммы E. coli, которые производят из метанола конкретные нужные человеку вещества. Если удастся внедрить бактерии гены метанмонооксигеназ, превращающих метан в метанол, и они будут работать, тогда «синтетические» метилотрофы смогут питаться метаном и появится новый способ утилизации этого парникового газа. Существующих метанотрофов сложно использовать для этой цели, так как им для жизни обычно нужна среда, далекая от лабораторной, — почва, лед или тела других организмов.
Кишечную палочку модифицируют самыми разнообразными способами, в том числе меняют набор источников атомов углерода, подобно тому, как это сделали в обсуждаемом исследовании. К примеру, в ноябре 2019 года израильские ученые представили штамм E. coli, способный создавать органические вещества из углекислого газа подобно тому, как это делают растения.
Светлана Ястребова
Это облегчило симптомы поражения мышц и нервов
Выращивание дрозофил с дефектом первого комплекса дыхательной цепи в среде с комбинацией 5-аминолевулиновой кислоты, гидрохлорида и железа натрия цитрата (5-ALA-HCl + SFC) увеличивает выработку АТФ за счет повышения активности второго и четвертого дыхательных комплексов. Активность первого комплекса при этом не меняется. Кроме того, у дрозофил снижалось накопление лактата и пирувата, которое происходит при дефекте первого комплекса, что, по-видимому, облегчало симптомы поражения мышц и нервов. Исследование опубликовано в Human Molecular Genetics. В митохондриях происходит окислительное фосфорилирование — многоэтапный процесс, в ходе которого окисляются восстановительные эквиваленты — восстановленные никотинамидадениндинуклеотид (НАДН) и флавинадениндинуклеотид (ФАДН2), — и вырабатывается АТФ. Происходит последовательный перенос электронов по дыхательной цепи — группе дыхательных ферментов в мембране митохондрии. Всего в цепи участвует пять комплексов дыхательных ферментов. Нарушение переноса электронов по дыхательной цепи сопровождается снижением выработки АТФ и вызывает митохондриальные заболевания. Наиболее часто «ломается» первый комплекс — НАДН-КоQ-оксидоредуктаза, или НАДН-дегидрогеназа. Его дефицит поражает органы и ткани с высокими энергетическими потребностями, таких как мозг, сердце, печень и скелетные мышцы. Обычно это проявляется тяжелыми неврологическими синдромами: например, наследственная оптическая нейропатия Лебера, синдром MELAS или синдром MERRF. Хотя первый комплекс отвечает за поступление наибольшего количества электронов в дыхательную цепь, второй комплекс — ФАД-зависимые дегидрогеназы, — работая параллельно с первым, также отвечает за вход электронов в цепь, передавая их, как и первый комплекс на убихинон (коэнзим Q). Потенциально повышение активности второго комплекса могло бы нивелировать снижение активности первого. Поскольку второй, третий и четвертый дыхательные комплексы и цитохром с содержат гемовые структуры, команда ученых под руководством Канаэ Андо (Kanae Ando) из Токийского столичного университета решили проверить, насколько эффективно будет применение предшественника гема 5-аминолевулиновой кислоты для повышения активности этих комплексов и восстановления синтеза АТФ у дрозофил с дефектом первого комплекса. Сначала ученые отключили у дрозофил ген, гомологичный NDUFAF6 и ответственный за экспрессию одного из регуляторных белков первого комплекса. У таких дрозофил мышцы были тоньше, хрупче и иннервировались хуже, чем у насекомых без нокдауна гена. Кроме того, самцы с неработающим геном погибали намного быстрее самок, и у них развивались более грубые нарушения опорно-двигательного аппарата. Затем ученые проанализировали как нокдаун гена первого комплекса влияет на экспрессию и активность других комплексов. Выяснилось, что нокдаун увеличивает экспрессию генов третьего и пятого комплексов, и снижает — четвертого. При этом активность второго и четвертого комплекса значительно повышалась после нокдауна у самок дрозофил. Ученые не обнаружили нарушений в процессах утилизации активных форм кислорода, однако у дрозофил обоих полов без работающего гена первого комплекса накапливался лактат и пируват. Чтобы проверить влияние комплекса 5-аминолевулиновой кислоты, гидрохлорида и железа натрия цитрата (5-ALA-HCl + SFC) на митохондрии дрозофил с нокаутированным геном, их выращивали в среде, содержащей этот комплекс. Такое воздействие значительно повышало уровни АТФ у самцов и самок дрозофил, при этом количество копий митохондриальной ДНК не изменялось, то есть препарат не увеличивал количество митохондрий. Экспрессия и активность дефектного первого комплекса никак не изменились, а активность второго и четвертого комплексов выросли у самцов. В целом, повышенная экспрессия генов третьего комплекса и активность второго и четвертого комплексов смягчали дефектные фенотипы. Помимо этого 5-ALA-HCl + SFC снижало накопление лактата и пирувата у самцов и самок с нокдауном гена первого комплекса, что потенциально смягчает метаболические нарушения, вызванные дефицитом первого комплекса. У самцов и самок мух-дрозофил, которых лечили 5-ALA-HCl + SFC, наблюдалось меньше дефектов опорно-двигательного аппарата, а продолжительность их жизни значительно увеличилась. Ученые рассчитывают проверить эффект такого лечения на животных с более сложным строением, чтобы подтвердить универсальность такого подхода к лечению митохондриальных нарушений. Не всегда нужна мутация, чтобы нарушить работу дыхательной цепи. Недавно мы рассказывали про то, что большое количество натрия из потребляемой соли нарушает дыхательную цепь митохондрий в регуляторных Т-лимфоцитах. Это приводит к активации аутоиммунных процессов.