Фотоиндукция увеличила скорость CRISPR в 100 раз

Американские ученые синхронизировали работу системы CRISPR-Cas9 при помощи света. Фоточувствительная химическая модификация направляющей РНК позволила не только одновременно разрезать ДНК в популяции клеток, но и сделать это гораздо быстрее, чем обычно. Исследование опубликовано в Science, также в журнале вышла сопутствующая редакционная статья.

На эффективность редактирования генома при помощи CRISPR-Cas9 влияет множество факторов, и один их них — время образования молекулярных комплексов. На то, чтобы комплекс РНК-Cas9 распознал мишень, связался с ней и осуществил разрез, требуется время. В одних клетках это происходит быстрее, в других медленнее, или вообще не происходит. Следствием этого, в частности, может быть проблема мозаичности эмбрионов, в результате которой разные клетки будущего организма содержат разные варианты гена. Даже в одной и той же клетке разные копии гена на двух хромосомах могут разрезаться с разной скоростью и эффективностью. Чаще всего случается так, что одна копия гена уже порезалась и «зашилась», а до другой комплекс вообще не добрался. По этой причине редактирование диплоидных клеток представляет определенные затруднения.

Чтобы синхронизировать работу CRISPR, исследователи разрабатывают индуцируемые варианты системы, которые могут включаться по сигналу извне. Биофизики из Университета Джона Хопкинса в Балтиморе под руководством Такджипа Ха (Taekjip Ha) разработали систему фотоиндуцируемого разрезания в системе CRISPR-Cas9, основанной на химической модификации направляющей РНК. После стимуляции светом с длиной волны 365 или 405 нанометров химические группы, блокирующие комплементарное связывание с ДНК в комплексе с Cas9, отщепляются и позволяют мгновенно осуществить разрез во всей популяции клеток одновременно.

Поиск мишени и разрезание ДНК в CRISPR-системе состоит из нескольких стадий. Сначала комплекс Cas9 с направляющей РНК (исходно у бактерий она состоит из двух молекул — crRNA и tracrRNA) ищет последовательность PAM, которая состоит всего из трех «букв», и связывается с ней. Затем двойная спираль ДНК расплетается и участок направляющей РНК, который, собственно и «направляет» нуклеазу к мишени, спаривается с одной из цепей по принципу комплементарности рядом с PAM. Для разрезания нужно спаривание участка в 20 нуклеотидов, но для того, чтобы комплекс распознал мишень, достаточно спаривания его первой половины (12 нуклеотидов), прилежащей к PAM. Если участок направляющей РНК искусственно обрезать до этой длины, весь комплекс застрянет на ДНК, и будет там сидеть, ничего не разрезая.

Ученые воспользовались этим свойством комплекса и синтезировали такие направляющие РНК, которые по умолчанию приводили бы к застреванию комплекса, но под действием светового сигнала полностью бы спаривались с ДНК. Для этого на самый удаленный от PAM конец вместо двух остатков урацила повесили модифицированные остатки тимина со светочувствительной 6-нитропиперонил-оксиметильной группой (разумеется, для того, чтобы это было возможно, пришлось подобрать такие мишени, у которых на конце были соответствующие остатки аденина).

Комплекс из модифицированной направляющей РНК и Cas9 собирали in vitro и вводили в клетки, где Cas9 связывался с ДНК. После стимуляции светом химические группы отщеплялись, формирование комплекса завершалось, и уже подготовленный Cas9 мгновенно вносил разрез в обе цепи ДНК. Свою систему авторы работы назвали very fast CRISPR (vfCRISPR). Исследователи смогли при помощи света прицельно активировать разрез только на одной хромосоме внутри клетки, а также изучили скорость сопутствующих процессов репарации.

Кроме того, авторы работы сравнили кинетику работы фотоиндуцируемой системы с ранее опубликованной химически индуцируемой. Оказалось, что с использованием заблокированной РНК средняя эффективность внесения двуцепочечных разрезов достигала 70 процентов, при этом большая часть разрезов вносилась в первые 30 секунд. В другой системе на то, чтобы достичь максимального количества разрывов, уходил час. Таким образом, скорость работы vfCRISPR увеличилась более чем в 100 раз.

Посмотреть на образование комплексов Cas9 с ДНК можно в этом видео от Visual Science.

Дарья Спасская