Японцы создали метки для автоматической идентификации нейронов нематод

Ученые из Японии нашли способ облегчить разметку нейронов нематод Caenorhabditis elegans. Для этого исследователи создали новую линию червей, нервные клетки которых экспрессируют набор маркеров, и алгоритм, который позволяет идентифицировать нейроны полуавтоматически. С помощью такого подхода точно удалось определить не все нейроны, для улучшения метода нужно расширять выборку и искать дополнительные маркеры. Статья опубликована в журнале BMC Biology.

У нематод Caenorhabditis elegans всего 302 нейрона. Морфология всех этих клеток, их пути дифференциации и связи хорошо изучены. Поэтому C. elegans является уникальной моделью, на которой можно изучать процессы как на уровне отдельных клеток, так и целых нейронных сетей. Современные методы позволяют визуализировать активность всей нервной системы этого круглого червя, в том числе если он свободно движется, с разрешением до одного нейрона. Но, к сожалению, определять, за какой именно из 302 нервных клеток мы наблюдаем, приходится вручную.

Для того, чтобы идентифицировать отдельные нейроны, используют в первую очередь расположение клеток. Но постоянно оно только на личиночных стадиях, а у взрослых червей вариабельно. Кроме позиции клетки также определяют по специфическим маркерам (например, флюоресцентным меткам) и морфологии. Однако все эти методы удобны, только если рассматривать ограниченное число нейронов. На уровне целого мозга определять каждую отдельную клетку трудно: необходимо слишком много маркеров, а морфологические особенности не всегда возможно рассмотреть.

Исследователи предпринимали несколько попыток автоматизировать определение нейронов C. elegans. Фухуй Лун (Fuhui Long) создал электронный 3D-атлас личинок нематод L1, в котором отмечены позиции 357 из 558 клеток червя и их варианты. Однако в работе не описаны нейроны головного конца нематод из-за того, что они расположены слишком плотно. В другом атласе с помощью флюоресцентных меток, положения и морфологии клеток размечены 154 из 959 клеток взрослых особей, но туда вообще не вошли нейроны. До сих пор получить информацию о позиции нейронов зрелых C. elegans можно было только из реконструкции Джона Уайта (John White) 1986 года, но в этой работе не указаны варианты расположения клеток и есть некоторые неточности, связанные с методологией приготовления образцов для электронной микроскопии.

Ю Тоёсима (Yu Toyoshima) из Токийского университета и его коллеги создали новый набор идентификаторов для нейронов C. elegans. Для этого они пометили специфичные для разных клеток промоторы флюоресцентной меткой. Промотор — участок ДНК, который служит стартом для начала транскрипции. В разных клетках работают свои промоторы, и можно сделать так, что при экспрессии конкретного промотора будет выделяться флюоресцентный белок. Изменение свечения меток, которое отображало паттерн работы промотора, и использовали исследователи для идентификации нейронов.

Исследователи наблюдали за экспрессией 35 различных промоторов в нервных клетках 311 нематод. Затем ученые сравнили расположение одних и тех же клеток у разных особей и определили, какие клетки могут сильно смещаться друг относительно друга и какие пары относительно постоянны в пространстве. 

Наконец, авторы выбрали три промотора, которые были активны в наибольшем числе клеток, и связали их с флюоресцентными метками двух цветов (третий световой канал был занят белком, который находится в ядрах нейронов) в отдельной линии C. elegans. Такая комбинация помогает определять оптимальное число нервных клеток (186 из 196 нейронов головы) в одной нематоде.

Ученые также создали автоматизированный алгоритм определения нейронов новой линии C. elegans. Он сравнивает экспрессию флуоресцентных маркеров и положение каждой нервной клетки нематоды с набором генерализованных атласов, которые были созданы на основе данных этого исследования. Метод также позволяет корректировать определение нейронов вручную.

Авторам удалось идентифицировать по паттерну экспрессии специфичных промоторов большинство нейронов головы C. elegans. Положение клеток было нестабильным у разных особей, поэтому определение нейронов по этому параметру не представляется возможным. Однако ученые обнаружили пары клеток, которые достаточно постоянны в пространстве друг относительно друга. Кроме того, исследователи обнаружили, что на положение части клеток влияет позиция глотки, которая может смещаться в процессе развития червя.

Алгоритм успешно справлялся с определением нейронов в новой линии нематод — в среднем он узнавал 78 процентов нервных клеток головы. Однако некоторые клетки не удалось идентифицировать вообще, и они не были представлены ни в одном атласе, а часть была обнаружена лишь в нескольких животных. Такие нейроны алгоритм определял с большой вероятностью ошибки. Для совершенствования метода необходимо проанализировать большее число особей, найти новые специфичные промоторы и пополнить базу данных маркеров нервных клеток C. elegans.

Полный коннектом Caenorhabditis elegans создали только в 2019 году. Однако нейроны этих червей и их связи исследованы давно, и на уровне отдельных клеток изучают различные нервные процессы нематод, например, хемотаксис. У этих удивительных животных даже нашли клетки, которые чувствительны к магнитному полю Земли.

Алиса Бахарева