Ген светлячка помог проследить за активностью мозга обезьяны
Исследователи разработали новую неинвазивную систему визуализации отдельных клеток в организме животного на базе модифицированного фермента люциферазы и ее синтетического субстрата. Детектируя биолюминесценцию в тканях, ученые смогли наблюдать за раковыми клетками в легком мыши и следить за активацией нейронов в мозге мыши и обезьяны. Работа опубликована в Science.
Люцифераза, окисляющая вещество под названием люциферин с испусканием света (процесс, известный как биолюминесценция), широко используется в экспериментальной биологии в качестве репортерного белка. В природе именно эта реакция помогает светиться светлячкам, и фермент светлячка является наиболее популярным в лабораториях. Биолюминесценция также используется для визуализации отдельных органов и тканей в организме лабораторных животных – для этого ген, кодирующий люциферазу, нужно заставить экспрессироваться в клетках нужной ткани. Люминесценцию при этом можно детектировать при помощи CCD-камеры.
Природный субстрат фермента – люциферин – в целом довольно плохо проникает в ткани и задерживается гематоэнцефалическим барьером, поэтому система плохо подходит для визуализации мозга. Чтобы преодолеть эти ограничения, химики разработали несколько синтетических субстратов для люциферазы. Японские ученые из института исследования мозга RIKEN показали, что один из них, акалюмин (AkaLumine), лучше всего подходит для визуализации глубоко залегающих тканей. Этот субстрат хорошо распределяется в организме, способен проникать в мозг, а самое главное, спектр люминесценции для него смещен в ближнюю инфракрасную область, поэтому излучение не поглощается тканями и его легко детектировать.
Чтобы оптимизировать люциферазу светлячка для работы с акалюмином, ученые провели несколько раундов случайного мутагенеза гена люциферазы, на каждом этапе отбирая лучшие варианты по силе люминесценции (этот метод называется направленной эволюцией белка). Итоговый вариант, который назвали Akaluc, содержал по сравнению с природной люциферазой 28 аминокислотных замен и окислял акалюмин на порядок более эффективно. Проверка in vivo показала, что мутантная люцифераза, к тому же, в несколько раз эффективнее синтезируется в клетках.
Для доказательства пригодности новой системы в качестве инструмента визуализации исследователи поставили несколько экспериментов на животных. В первом эксперименте мыши в кровь вкололи экспрессирующие Akaluc раковые клетки линии HELA и акалюмин. Большая часть клеток после этого застряла в легочных каппилярах, где ученые, благодаря сигналу люминесценции, в 50 раз превышающему значение для обычной люциферазы, смогли их наблюдать. Для детекции оказалось достаточно ввести мышам всего несколько клеток (от одной до десяти).
Во втором эксперименте мышам в полосатое тело мозга вкололи вирусный вектор с мутантной люциферазой. Оказалось, что сигнал люминесценции достаточно силен, чтобы активность полосатого тела свободно двигающихся животных можно было регистрировать на видео. При этом акалюмин можно было не колоть, а просто добавлять мышам в поилку. В другом эксперименте ученым удалось зарегистрировать активность нейронов гиппокампа, экспрессирующих мутантную люциферазу, при обучении мышей в лабиринте.
В последней части работы исследователи проверили эффективность работы системы в мозге обезьяны-мармозетки. Животному также ввели ген мутантной люциферазы в составе вирусного вектора в правую часть полосатого тела. Сигнал люминесценции можно было наблюдать при помощи камеры абсолютно неинвазивно через 20-30 минут после того, как обезьяне давали акалюмин. Экспрессия люциферазы в мозге животного продолжалась как минимум в течение года после введения в мозг. При этом поведение обезьяны было абсолютно нормальным, то есть система визуализации не обладала никакими побочными эффектами. Авторы работы подчеркивают, что новая система обладает огромным потенциалом для картирования и визуализации работы нейронов у животных в естественных условиях.
Для биовизуализации исследователи ранее также успешно применили флуоресцентные наночастицы – квантовые точки. При помощи квантовых точек на основе арсенида индия ученым удалось по изменению интенсивности свечения зарегистрировать дыхание и сердцебиение свободно двигающейся мыши и проследить за ростом опухоли в ее организме.
Дарья Спасская
Также на когнитивное снижение повлияли варианты Гена APOE: аллель APOE4 его ускорила, а аллель APOE2 — замедлила
Исследователи из Колумбии и США изучили, как генотип аполипопротеина и годы образования влияют на когнитивные функции при наследственной болезни Альцгеймера. Выяснилось, что у носителей мутации PSEN1 E280A, связанной с семейной болезнью Альцгеймера, когнитивное снижение наступает раньше и развивается быстрее, если у них в то же время есть аллель APOE4, а у таких же носителей, но с аллелью APOE2, это снижение происходит медленнее. Также более медленное снижение когнитивных способностей было характерно для пациентов, которые больше лет жизни потратили на учебу, — и это к тому же ослабляло влияние особенно опасных вариантов APOE. Результаты опубликованы в Nature Communications. При семейной или наследственной болезни Альцгеймера (БА) когнитивный спад наступает рано и за несколько лет прогрессирует до слабоумия. Семейную болезнь Альцгеймера вызывают некоторые мутации, например, мутация E280A в гене мембранного белка пресенелина PSEN1. Еще один ген, влияющий на развитие и течение БА — ген белка аполипопротеина Е (APOE). Разные варианты этого гена связаны с большим или меньшим риском спорадической (ненаследственной) болезни Альцгеймера: аллель APOE4 повышает риск, а аллель APOE2 снижает его. О том, как варианты APOE влияют на развитие семейной БА известно мало. Одно небольшое исследование показало, что деменция у носителей мутации PSEN1 E280A наступает раньше, если у них есть аллель APOE4. Другое исследование не обнаружило влияния APOE4, но выявило, что аллель APOE2 задерживает клиническое начало заболевания примерно на 8 лет. Кроме того, на развитие БА влияют другие факторы: образ жизни, социально-экономические условия и другие показатели здоровья. Стефани Лангелла (Stephanie Langella) из Гарвардской медицинской школы вместе с коллегами из Колумбии и США решила выяснить, как варианты APOE и количество лет учебы влияют на когнитивные показатели пациентов с наследственной БА (исследователи не выделяли отдельно высшее образование или ученую степень, а смотрели именно на число лет, уделенных образованию). Для этого они проанализировали данные 675 носителей мутации E280A и 594 пациентов, у которых этой мутации не было. Носители и неносители мутации были членами одних и тех же семей. Ученые сравнивали баллы пациентов в краткой шкале оценки психического статуса (MMSE), которую используют для диагностики клинических проявлений деменции. Баллы MMSE у носителей и неносителей мутации PSEN1 E280A начинали различаться уже в возрасте 31,5 года — с этого момента когнитивные показатели носителей снижаются намного быстрее. У пациентов с мутацией E280A, у которых также была аллель APOE4 (141 человек), клиническое начало БА было более ранним, а у пациентов с мутацией E280A, но без аллели APOE4 (534 человека) — наоборот, наступало позже. Расхождения начинались в возрасте 44,3 лет — как раз во столько появляются первые признаки болезни Альцгеймера у пациентов с наследственной формой. Другая аллель, APOE2, напротив, была связана с более медленным когнитивным снижением в группе носителей PSEN1 E280A. А вот когнитивные траектории пациентов без мутации E280A были примерно одинаковыми и не зависели в от варианта APOE. Также исследователи обнаружили, что возраст начала клинических проявлений БА у пациентов с мутацией PSEN1 E280A зависел от количества лет, которые они потратили на учебу. Их когнитивные показатели снижались тем медленнее, чем больше они учились, — и это проявлялось особенно сильно у носителей аллели APOE4 и неносителей APOE2. То есть отрицательный эффект аллели APOE4 ослаблялся. Почти то же было и с неносителями мутаций, связанных с БА: более долгая учеба была связана с более высокими баллами MMSE, но здесь варианты APOE роли не играли. Пока не ясно, как именно аллель APOE4, связанная с большим риском, ухудшает течение семейной болезни Альцгеймера, и как другая аллель — APOE2 — от нее защищает. Но, как видно, большая продолжительность учебы снижает дополнительный риск. А иногда от вредного действия мутаций защищают другие мутации. Недавно исследователи обнаружили мутацию, которая отсрочила развитие семейной болезни Альцгеймера у мужчины. Это был редкий вариант гена RELN — H3447R или RELN-COLBOS. Клинические проявления начались у пациента почти на 20 лет позже обычного. Мужчина был не первым счастливчиком: до этого подобный случай был с женщиной, у нее мутация была как раз в гене APOE.