Бактерий заставили писать отчеты о работе с помощью CRISPR
Ученые придумали, как использовать систему CRISPR-Cas для того, чтобы заставлять клетки последовательно записывать в собственный геном «историю» биологических сигналов. Это позволит отслеживать, например, изменения в метаболизме и уровне экспрессии генов, а также различать клеточные линии по характеру проходящих в них биохимических процессов. Исследование опубликовано в журнале Science.
Система CRISPR-Cas широко используется сейчас для геномного редактирования , но в природе она нужна бактериям, в частности, для того, чтобы бороться с чужеродным (например, вирусным) генетическим материалом. Система обладает способностью «вписывать» в собственный геном кусочки чужеродной ДНК, чтобы затем, пользуясь этими записями, как шаблонами, находить такую ДНК в цитоплазме и разрезать ее, борясь таким образом с патогенами. Участки-шаблоны называются «спейсерами», и располагаются они в строго очередном порядке — новые спейсеры всегда добавляются в CRISPR-кассету в геноме с одного и того же конца.
Ученые воспользовались этой особенностью CRISPR-системы и разработали технологию, которую назвали TRACE (от английского слова «отслеживать»; аббревиатура расшифровывается как «Temporal Recording in Arrays by CRISPR Expansion»). Технология основана на следующем принципе: небольшие участки ДНК, которые называются триггерными спейсерами, «записываются» в CRISPR-кассету под воздействием определенных сигналов, а когда сигналов нет, вместо этого туда записываются обычные, «референсные» спейсеры в привычном для клетке темпе. После этого, прочтя кассету, можно детектировать, когда и какой именно спейсер в нее встроился, и понять таким образом, какие изменения происходили в клетке с течением времени.
Триггерные спейсеры появляются в клетке за счет специальных искусственных плазмид (кольцевых молекул ДНК, несущих несколько генов, которые могут самостоятельно реплицироваться). Они были сконструированы таким образом, что при повышении уровня заданной сигнальной молекулы (изначально это был ИПТГ, изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид) в среде у них повышалась экспрессия белка, ответственного за репликацию плазмиды, что, в свою очередь, существенно увеличивало количество плазмид этого типа в клетке. Убедившись, что эта система работает, ученые также сделали другие плазмиды, с генами, кодирующими белки Cas1 и Cas2. Эти белки ответственны за встраивание новых спейсеров в CRISPR. Экспрессия этих генов также контролировалась с помощью определенных сигнальных молекул (ангидротетрациклина). Включение экспрессии генов второго типа плазмид (то есть синтез Cas1 и Cas2) обуславливало успешное встраивание в CRISPR-кассеты значимого количество спейсеров из плазмид первого типа, которых в клетке при активации ИПТГ становилось очень много.
Спейсеры встраивались в кассеты с разной скоростью, и для учета этих различий ученые создали аналитическую модель, позволяющей рассчитать вероятность встраивания тех или иных спейсеров в определенные позиции при возникновении или отсутствии сигнала. Протестировав технологию на кишечных палочках (Escherichia coli), они убедились, что система TRACE позволяет успешно отслеживать добавление и исключение ИПТГ во времени. После этого они расширили эксперимент, заставив систему в трех разных типах клеток реагировать на три разные типа биологических сигналов в течение трех дней. В качестве сигналов использовали медь, трегалозу и фукозу, которые появлялись в среде в разное время в разном порядке. Система буквально записывала соответствующую последовательность в CRISPR и потом эту запись можно было прочесть с помощью секвенирования и расшифровать, пользуясь аналитической моделью.
Ученые считают, что новая система, последовательно записывающая происходящее в клетке, может быть использована для временной оценки изменения экспрессии генов и метаболических процессов, в том числе в средах, в которых неудобно отслеживать эти процессы иным образом — например, в микробиомах кишечника животных или в морских сообществах бактерий. Скорость записи можно будет также редактировать с помощью изменения работы белков Cas — ученые собираются далее совершенствовать систему, делая ее более точной и чувствительной. Добившись определенной степени чувствительности, можно будет записывать изменения даже внутри отдельных клеток, полагают они.
А о редактировании всех точечных мутаций с помощью CRIPSR, но без разрезания двойной цепи ДНК, вы можете прочитать здесь.
Это произошло после формирования нейронной связи между клетками циркадных часов и Dh44-нейронами
Биологи определили момент, в который циркадные часы начинают управлять циклами сна и бодрствования у личинок плодовых мушек. Оказалось, это происходит в начале третьего дня развития под влиянием новой связи между нейронами циркадных часов и клетками Dh44, которые контролируют бодрствование личинок. Кроме того, после формирования этой связи у личинок появилась долгосрочная память. Исследование опубликовано в журнале Science Advances. Циркадные ритмы у многих видов формируются еще на самых ранних этапах развития. Так, например, у млекопитающих клетки супрахиазматического ядра детеныша синхронизируют свою ритмическую активность еще во время беременности. Однако многие матери новорожденных могут подтвердить, что дети в этом возрасте редко спят ночью и бодрствуют днем — в основном их сон равномерно распределен по суткам. Исследования подтверждают, что циклы сна и бодрствования у младенцев чаще всего появляются от трех до двенадцати месяцев. До сих пор не было понятно, почему, несмотря на работу клеток циркадных часов, циклы сна и бодрствования формируются довольно поздно и как этот процесс влияет на другие функции мозга — например, долговременную память. Исследователи из университета Пенсильвании под руководством Эми По (Amy R. Poe) изучили аналогичный процесс на дрозофилах. Биологи отследили момент, в который у личинок мушек появляются циклы сна и бодрствования — это произошло в начале третьего дня развития. Чтобы понять, что именно происходит с циркадными ритмами в этот момент, исследователи изучили активность нейронов мозга у личинок. Прежде всего они проверили нейроны, которые производят нейропептид Dh44, поскольку они расположены в области циркадных часов у взрослых мушек.Для этого они создали трансгенных насекомых, у которых эти клетки синтезировали теплочувствительный ионный канал. Таким образом, когда личинок помещали в теплую среду, в Dh44-нейронах начинался ионный ток и те активировались. Оказалось, что эти клетки действительно участвуют в регуляции циклов сна: после их активации личинки на второй стадии меньше спали в течение суток (p < 0,0001). Тогда исследователи решили изучить, как активность этих клеток меняется при переходе со второй стадии личинок на третью — в момент появления ритмов сна. Оказалось, активность Dh44 не отличается на первой и второй стадии, но снижается в начале третьей. Это согласовывалось и с повышенным количеством сна у личинок в этот день: активность нейронов снизилась и они перестали оказывать свое бодрящее действие на личинок. Биологи предположили, что в этот момент Dh44-нейроны связываются с клетками, которые задают общий циркадный ритм организму мушек. Для этого они отследили нейронные связи этого мозгового центра. И действительно, при переходе со второй стадии на третью Dh44-нейроны сформировали связь с одной из клеток часов — DN1a. Ученые также подтвердили, что активация DN1a действительно «включает» Dh44 и увеличивает длительность бодрствования у личинок. Тогда исследователи решили проверить, как появление связи циркадных ритмов с циклами сна и бодрствования влияет на другие процессы в мозге насекомых. Зная, что переход памяти из кратковременной в долговременную происходят во время сна, биологи протестировали оба типа памяти у животных. Для этого они использовали стандартный для таких задач тест — проверяли, как личинки запоминают отвратительные запахи. И на второй, и на третьей стадии личинки одинаково хорошо проходили тесты на кратковременную память, а вот долговременная память появилась лишь при переходе между ними. При этом активация Dh44-нейронов, которые снижали количество сна у личинок, нарушала процессы долговременной памяти. Так, биологи не только в подробностях описали, как клетки циркадного ритма начинают контролировать циклы сна и бодрствования, но и показали, что этот процесс очень важен для развития таких сложных когнитивных функций как долговременная память. Сон и память действительно тесно связаны — депривация сна способна даже стирать воспоминания. Недавно мы писали об исследовании, в котором такие воспоминания удалось восстановить у мышей.