Генетики научились редактировать РНК в 900 раз точнее
Генетики разработали новую систему для редактирования РНК без разрезания на основе системы CRISPR-Cas13, а затем усовершенствовали ее, снизив количество совершаемых ей ошибок в 900 раз. Исследование опубликовано в Science.
Редактирование РНК, в отличие от ДНК-редактирования, позволяет, во-первых, вносить изменения в клетку в заданные интервалы времени, а во-вторых, не вызывает столько вопросов и проблем, связанных с этикой геномного редактирования в целом. РНК со временем деградирует, и все связанные с ней изменения, таким образом, обратимы. Подробнее о системе CRISPR-Cas13, которая позволяет редактировать РНК, можно прочитать здесь.
Ученые из Гарварда и MIT систематически проанализировали ряд белков семейства Cas13, чтобы отыскать наиболее эффективную форму этого белка, и выбрали кандидата, принадлежащего бактерии рода Prevotella, который назывался PspCas13b. По сравнению со всеми своими ортологами он наиболее эффективно находил и инактивировал нужную РНК, разрезая ее. Это само по себе уже являлось полезной находкой, поскольку новые эффективные «ножницы» можно будет применять в других типах экспериментов. В данном же проекте ученые создали модифицированную форму белка, который успешно находил свою цель, но при этом не был способен ее разрезать.
После этого белок Cas13b «сшивали» с белком ADAR2 — аденозиновой РНК-деаминазой, которая способна превращать аденозин в инозин. Инозин расценивается клеткой как гуанозин — таким образом, этот механизм равносилен замене А на G. В результате нужное место отыскивается с помощью системы CRISPR-Cas13b, но РНК при этом не расщепляется, а подвергается дезаминированию с помощью ADAR2. Эта система получила название REPAIR (RNA Editing for Programmable A to I Replacement); эффективность ее работы составила, в среднем, от 20 до 40 процентов, а в некоторых случаях это число достигло 89 процентов.
С помощью методов белковой инженерии ученые затем создали усовершенствованный вариант системы, который они назвали REPAIRv2. Он продемонстрировал в 900 раз большую специфичность к целевым мутациям — таким образом, существенно снизилось количество ошибок редактирования. Для того, чтобы протестировать работу новой системы, были использованы длинные молекулы РНК с известными мутациями. Эффективность работы REPAIRv2 по-прежнему составила от 20 до 40 процентов, но при этом внецелевых мишеней новый вариант практически не затронул. Таким образом удалось, в частности, в культуре клеток HEK293FT отредактировать мутации, вызывающие у человека врожденную апластическую анемию и нефрогенный несахарный диабет .
Система успешно редактирует заданные наборы мутаций, что не может излечить генетические заболевания сами по себе, но может весьма существенно сказаться на их развитии, полагают ученые. Среди заболеваний, которые ассоциированы с мутациями G в A — мышечная дистрофия Дюшенна, болезнь Паркинсона и фокальная эпилепсия.
В будущем ученые собираются повышать эффективность работы системы REPAIRv2 и разработать методики, позволяющие направлять такие системы в заданные ткани.
А о другой работе группы ученых из Гарварда и MIT, опубликованной одновременно и посвященной деаминазам и редактированию, но касающейся ДНК и методики, впервые позволившей превращать пары A-T в пары G-C, вы можете прочитать здесь.
Анна Казнадзей
Ее произвели макрофаги в верхнем шейном нервном узле
Немецкие и американские исследователи пришли к выводу, что расстройства сна при хронических заболеваниях сердца связаны с нарушением симпатической иннервации шишковидного тела, вырабатывающей мелатонин, связанными с сердцем провоспалительными иммунными клетками. Публикация об этом появилась в журнале Science. У людей и других млекопитающих смену периодов сна и бодрствования контролирует секреция мелатонина, синхронизированная с 24-часовым циклом смены дня и ночи на Земле. Этот гормон вырабатывает шишковидное тело (эпифиз), расположенное в надталамической области головного мозга, в ответ на уровень симпатической иннервации из верхнего шейного узла. Помимо эпифиза и некоторых других органов этот узел иннервирует и сердце. Известно, что при хронических сердечных заболеваниях зачастую снижается уровень мелатонина и возникают сопутствующие нарушения сна, которые негативно сказываются на течении болезни и качестве жизни пациента. Механизмы этого явления изучены не были, при этом они могли бы дать почву для разработки новых методов лечения. Чтобы разобраться в этом вопросе, сотрудники различных научных центров Германии и США под руководством Штефана Энгельхардта (Stefan Engelhardt) из Мюнхенского технологического института изучили посмертные препараты эпифизов семи человек с кардиологическими заболеваниями и девяти без них. Оказалось, что при болезнях сердца значительно снижена плотность аксонов (то есть иннервация) в этой железе. Выяснив это, авторы работы перешли к экспериментам на мышах с двумя искусственно вызванными заболеваниями сердца: перегрузкой левого желудочка давлением путем хирургического сужения аорты и сердечной недостаточностью с сохранной фракцией выброса. Уровень мелатонина у таких животных был снижен, что сопровождалось нарушениями циркадианных ритмов. Генетическая маркировка помогла выявить у них резкое снижение симпатической иннервации эпифиза без нарушения его внутренней структуры и анатомического окружения. Морфометрическое и гистологическое исследование верхнего шейного узла продемонстрировало его значительную гипертрофию с замещением фиброзной соединительной тканью, что свидетельствует о тяжелом, возможно необратимом повреждении органа. Аналогичные изменения исследователи увидели на посмертных препаратах верхних шейных узлов кардиологических пациентов — рубцовая ткань замещала до 70 процентов их объема. При этом степень поражения узла значительно коррелировала со степенью ремоделирования миокарда в результате заболевания. Это подтвердили у живых пациентов с помощью УЗИ, а также обнаружили у них связь размеров верхнего шейного узла с фракцией выброса (функциональным показателем сердечной деятельности). После этого авторы работы выполнили секвенирование РНК одиночных клеток и ядер верхнего шейного узла мышей с кардиологическими заболеваниями, а также иммуногистохимическое окрашивание разных пулов его клеток и нервных связей с эпифизом. Выяснилось, что симпатическая иннервация железы значительно снижалась еще до декомпенсации сердечной недостаточности, и что при этом узел инфильтрирован провоспалительными макрофагами. В нервных узлах, не иннервирующих сердце, подобной инфильтрации не наблюдалось, уровни биомаркеров общего воспаления повышены не были, что свидетельствует о связи этих макрофагов именно с заболеванием сердца. Схожую картину удалось пронаблюдать и в посмертных образцах кардиологических пациентов. Транскриптомное профилирование межклеточных взаимодействий в верхнем шейном узле мышей на ранних стадиях болезни сердца показало, что сильнее всего нарушены связи между макрофагами и симпатическими нейронами, иннервирующими шишковидное тело. Еженедельные инъекции ингибитора макрофагов клодроната в этот узел сразу после операции по сужению аорты предотвращали денервацию железы и снижение уровня мелатонина. Эксперименты по совместному выращиванию клеток на питательной среде, подтвердили, что центральную роль в гибели симпатических нейронов играют активированные провоспалительные макрофаги. В 2020 году французские ученые обнаружили, что если люди засыпают позже привычного времени, то во время сна и на следующий день пульс у них значительно превышает норму. То же происходит и при засыпании на более чем полчаса раньше обычного, однако пульс при этом возвращается к норме уже через несколько часов сна. Годом позже британские исследователи показали, что с наименьшим риском сердечно-сосудистых заболеваний связан отход ко сну между 22 и 23 часами.