Микрофлюидика в 1000 раз увеличила чувствительность иммунохимического анализа белков

Коллектив ученых из Израиля и Швейцарии создал комбинированный иммунохимический метод обнаружения белков, позволивший на три порядка (в 1000 раз) снизить минимальный порог определяемых концентраций по сравнению с традиционными системами такого класса. Такого результата удалось добиться благодаря изотахофоретической фокусировке определяемого вещества в микрофлюидном канале с пришитыми к стенке антителами. Статья, описывающая новое исследование, вышла в мае 2017 года и попала на обложку июльского номера Analytical Chemistry.

Определение наличия и концентраций белков является одним из ключевых этапов многих методов диагностики, а также фундаментальных исследований в медицине и биологии. Однако у белков есть существенное и неприятное отличие по сравнению с другими исследуемыми веществами, например нуклеиновыми кислотами (ДНК и РНК): белки практически невозможно амплифицировать, то есть быстро и селективно синтезировать множество их копий, чтобы увеличить концентрацию и упростить их обнаружение. Даже если удается создать каскад антител, который в конечном итоге эффективно увеличит концентрацию определяемого вещества, скорость такого процесса все равно будет определяться исходным содержанием белка. По этим причинам все время происходит поиск новых, более эффективных методов быстрой фокусировки. 

Авторы нового исследования предложили эффективную комбинацию нескольких хорошо изученных аналитических подходов: изотахофореза, микрофлюидики и иммунохимического анализа. Первый метод является разновидностью электрофореза, то есть основан на движении заряженных частиц (а все белки так или иначе заряжены) в электрическом поле. Изотахофорез отличается от аналогов тем, что в нем исследуемое вещество помещают в один канал с ведущим и замыкающим электролитами. Первый движется в поле заведомо быстрее определяемого вещества, а второй — заведомо медленнее. За счет этого фактически электрическое поле в канале распределяется ступеньками — в зоне ведущего электролита оно меньше, а в зоне замыкающего — оно больше, поэтому исследуемое вещество вынуждено фокусироваться на границе этих двух зон.

Помимо собственно фокусировки изотахофорез одновременно позволяет перемещать исследуемое вещество в нужную часть канала, и здесь в ход идет второй метод из комбинации: имуннохимический анализ. Авторы модифицировали небольшую область канала антителами, специфичными к изучаемому белку (для этого исследования авторы выбрали зеленый флуоресцентный белок, GFP). В традиционных методах исследуемое вещество в общем потоке пропускают над такой модифицированной зоной, и часть растворенного белка взаимодействует со специфичными к нему антителами, так происходит первый этап детектирования. Новый подход позволил дополнительно сфокусировать суспензию над пришитыми антителами, таким образом увеличив «шанс» белка связаться с антителом и увеличить чувствительность всего метода.

Ученые использовали несколько вариаций своей системы. В простейшем случае сфокусированному «облаку» белка давали «проплыть» над антителами без остановки. Этот подход оказался наименее эффективным. На следующей итерации авторы выключали электрическое поле, когда исследуемое вещество оказывалось ровно над модифицированной областью канала (для этого за суспензий белка следили при помощи флуоресцентного микроскопа). В этом случае удалось в 1000 раз снизить порог определяемой концентрации по сравнению с традиционной, несфокусированной системой, однако наблюдались и минусы: с выключенным полем облако белка довольно быстро размывалось вследствие диффузии, что вновь снижало чувствительность системы.

Наконец, авторы предложили третий, наиболее продвинутый подход: как только сфокусированное облако белка достигало пришитых антител, ученые включали дополнительный насос, толкавший жидкость в противоположную электрическому полю сторону. Таким образом удавалось одновременно сохранять суспензию сфокусированной и удерживать ее ровно над антителами. В этом случае увеличение чувствительности могло достигать четырех порядков (10000 раз) по сравнению с обычной системой, в которой исследуемый раствор без фокусировки прокачивается над пришитыми антителами.

Авторы отмечают, что одним из главных преимуществ нового метода, помимо чувствительности, является относительная простота и дешевизна, так как изотахофорез не предполагает использования какого-либо сложного и высоко специфичного оборудования. Однако остается открытым вопрос правильного подбора электролитов (ведущего и замыкающего) и более чувствительного детектирования связавшихся белков. Здесь авторы предлагают использовать разрешенную по времени флуоресцентную спектроскопию или другие методы биофотоники, например, FRET — ферстовский резонансный перенос энергии. Этот метод позволяет с очень высокой точностью детектировать, на каком расстоянии друг от друга находятся два флуорофора — вещества или фрагмента фещества, обладающего флуоресцентными свойствами.

Микрофлюидные методы, использующие те или иные механизмы движения жидкостей в тонких каналах, все чаще становятся базой для новых аналитических систем. Например, при помощи микрофлюидного чипа удалось разглядеть в реальном времени слияние яйцеклетки и сперматозоида. Целью микрофлюидики часто называют создание так называемых «лабораторий-на-чипе» — миниатюрных устройств, позволяющих проводить серии сложных анализов благодаря сложной системе микроканалов, расположение которых немного напоминает сеть медных дорожек на электронном чипе. В настоящий момент чаще всего микрофлюидные чипы специализируются на какой-то одной операции, например, могут бесконтактно отделить раковые клетки от здоровых.

Тарас Молотилин