Специалисты из Университета Калифорнии (США) разработали новый метод окраски ДНК, который позволяет избирательно «разглядеть» хроматин — ДНК в комплексе с белками — в ядре при помощи электронной микроскопии. Благодаря усовершенствованному окрашиванию, исследователям удалось прямо в клетке изучить трехмерную структуру хроматина как в интерфазном ядре, так и в составе хромосом в процессе клеточного деления. Упорядоченных уровней упаковки хроматина, которые изображают в учебниках, ученые не нашли. Оказалось, что хроматин в ядре и в хромосомах на самом деле упакован «как попало». Исследование опубликовано в журнале Science.
Суммарная длина ДНК в клетке человека составляет около двух метров, а объем ядра, где она содержится, — несколько микрометров. Классическая модель, описанная в учебниках, предполагает, что ДНК содержится в ядре в упакованном виде. Начальный уровень компактизации представляет собой комплекс ДНК с белками-гистонами. Когда ДНК и гистоны объединяли в пробирке, они формировали структуру диаметром 11 нанометров, напоминающую бусы, где ДНК была через равные промежутки намотана на гистоновые комплексы. Предполагалось, что такая нить уложена в фибриллы диаметром 30 нанометров.
Для того чтобы в митозе из деконденсированного хроматина сформировать хромосомы, фибриллы должны последовательно упаковаться в 120-нанометровые структуры, затем в хроматиды диаметром 300 и 700 нанометров. Все эти структуры действительно наблюдали, однако в искусственных условиях — ДНК формирует их либо в растворе, либо в специально обработанных ядрах, из которых удалили все лишние компоненты.
Попытки «прижизненного» изучения ДНК в клетках давно заставили исследователей усомниться в устоявшейся модели, но существующие методы не позволяли изучать хроматин прямо в ядре. К примеру, криоэлектронная томография позволяет делать снимки клеточных структур с высоким разрешением, однако ДНК недостаточно контрастна на фоне окружающего льда. Электронная микроскопия уже применялась для изучения ультратонкой структуры хроматина, но она также требует контрастирования соединениями тяжелых металлов, которые плохо либо недостаточно селективно связываются с ДНК.
Чтобы решить проблему контрастирования хроматина в клетке для последующего микроскопирования, специалисты из Национального центра микроскопии и исследования изображений университета Калифорнии разработали трехступенчатую схему окраски.
Ученые подобрали флуоресцентный краситель, специфично связывающийся с ДНК прямо в клетке, который при возбуждении создавал бы вокруг себя локальное повышение концентрации свободных радикалов. Этот эффект должен был поспособствовать полимеризации другого вещества, диаминобензидина, которым специально обрабатывали клетки. Получившаяся полимерная пленка на поверхности ДНК хорошо связывала оксид осмия —препарат, использующийся для контрастирования образцов в электронной микроскопии.
Таким образом, ученым удалось добиться селективного окрашивания ДНК, которое бы позволило с высоким разрешением «прижизненно» изучать хроматин.
В основном эксперименте исследователи обратились к электронной микротомографии (EMT). В окрашенных клетках эпителия и остеосаркомы человека были сделаны снимки множества слоев, которые затем объединили в трехмерное изображение. Так как метод получения изображения объединил селективное окрашивание хроматина и томографию, ученые назвали его ChromEMT.
Получившиеся 3D-модели ядер позволили не просто разглядеть нити хроматина, но и измерить их диаметр. Кроме того, компьютерная обработка изображений позволила рассчитать объемную концентрацию хроматина в разных участках интерфазного ядра (то есть в тот момент, когда клетка не делится) и непосредственно в хромосомах в процессе деления. Оказалось, что хроматин как в интерфазном ядре, так и в составе хромосом существует в виде нитей диаметром 5–12 и 12–24 нанометра.
Средний диаметр нитей составил 14 нанометров. Разные участки ядра отличались только концентрацией хроматина, которая не превышала 52 процента. В интерфазном ядре средняя концентрация хроматина составила 30 процентов, а в хромосоме — 42 процента. Нити могут формировать петли и скопления, но упорядоченных структур типа фибрилл они не образуют.
Для сравнения авторы работы взяли ядра клеток крови цыпленка, на которых часто проводятся исследования структуры хроматина, и подготовили их стандартным образом, то есть обработали солевым раствором. После этого ДНК в таких ядрах изучили методом ChromEMT. На изображениях действительно удалось детектировать 30-нанометровые фибриллы и другие структуры, соответствующие классической модели.
Для этого феномена может быть два объяснения, считают авторы: либо фибриллы являются артефактом пробоподготовки, либо структура хроматина в разных типах клеток существенно различается. В любом случае, «классическую» модель упаковки ДНК больше нельзя считать стандартной.
Неупорядоченная упаковка хроматина, которую обнаружили исследователи, лучше согласуется со всеми биохимическими функциями, которые выполняет ДНК. Отсутствие жестких структур позволяет как угодно сгибать нити без пространственных ограничений, что позволяет осуществлять любые дальние взаимодействия. В неупорядоченном виде проще обеспечить доступ различных модифицирующих ферментов, которые навешивают эпигенетические метки, к ДНК и гистонам. Кроме того, «хаотичная» структура хроматина позволяет очень быстрый переход из неактивного (гетерохроматин) в активное состояние.
Про то, как ученые прижизненно изучают активность хроматина и его эпигенетический статус, мы уже
. Кроме того, мы рассказывали, как
гетерохроматин у дрозофилы и как российские ученые
трехмерную структуру хромосом в оплодотворенной яйцеклетке.
Дарья Спасская
Но сработала только низкая доза
Ученые из США ввели макакам-резус белок Клото. Уровень сывороточного Клото вырос в пять раз после инъекции белка. В итоге обезьяны почти на 20 процентов лучше справились с задачей на память, и эффект не прошел даже после двух недель. Но если на мышах работали разные дозы белка, то макакам хватило 10 микрограмм на килограмм массы тела — большие дозы не улучшали память. Результаты опубликованы в Nature Aging. В конце 20 века ученые открыли белок Клото (Klotho), который назвали в честь древнегреческой богини, прядущей нить жизни. Выяснилось, что мыши с дефектным геном Klotho начинают стареть уже спустя 3–4 недели после рождения, а еще у них развивается остеопороз, атеросклероз и другие патологии, а к двум месяцам они умирают. Мыши, чрезмерно экспрессирующие Klotho, напротив, живут на 20–30 процентов дольше, а их память лучше. Еще сверхэкспрессия белка защищала мозг мышей от повреждений, связанных с болезнями Альцгеймера и Паркинсона. Люди с повышенными уровнями белка тоже живут дольше, их когнитивные способности лучше, а еще у них ниже риск развития деменции и болезни Альцгеймера. В организме синтезируется две формы белка Клото — трансмембранная и секретируемая. В крови еще циркулирует растворимая форма белка, которая получается, когда ферменты отрезают от трансмембранного белка кусок. Растворимая форма может действовать как гормон, влияя на сигналинг инсулина, фактора роста фибробластов (FGF), функцию Wnt и NMDAR. Растворимую форму Клото вводили мышам в виде инъекций, и это повышало синаптическую пластичность, улучшало познание и устойчивость нейронов к старению. Стейси Кастнер (Stacy A. Castner) из Йельской школы медицины и ее коллеги решили проверить, улучшится ли память у нечеловеческих приматов, макаков-резус (Macaca mulatta), если им подкожно ввести белок Клото. Макаки-резус, как и люди, страдают от возрастного когнитивного снижения, хотя и без значительной потери нейронов. Сначала белок Клото макак ученые ввели мышам — в дозировке 10 микрограмм белка на килограмм массы тела. В предыдущих исследованиях такая доза увеличивала синаптические и когнитивные функции мышей. Здесь спустя 4 часа у мышей улучшилась синтетическая пластичность и рабочая память, которую проверяли в У-образном лабиринте. Уровень белка Клото в сыворотке мышей после инъекции увеличился в шесть раз. Затем ученые попытались повысить уровень белка в сыворотке стареющих макак, которым было в среднем около 22 лет (что эквивалентно человеческим 65), до того же уровня. Для этого они вводили макакам разные дозы Клото: от 0,4 до 30 микрограмм на килограмм массы тела. Доза в 10 микрограмм на килограмм повысила уровень сывороточного белка в пять раз. Уровень Клото в человеческой пуповинной крови тоже примерно в пять раз выше, чем в крови взрослых, — поэтому на дозе в 10 микрограмм ученые и остановились. Обезьян учили запоминать расположение отсека с пищевым вознаграждением, и таким образом оценивали их рабочую память. Задачи с нормальной сложностью, в которых было от 4 до 7 отсеков, они выполняли успешно, но не всегда справлялись с повышенной сложностью, когда отсеков было уже от 6 до 9. Уже через четыре часа после однократной инъекции белка Клото макаки стали лучше решать задачу, особенно — ее сложный вариант. Процент правильных ответов в сложной задаче увеличился с 45 до почти 60 (P = 0,0077). Этот эффект сохранялся спустя две недели и не зависел от пола. А вот более высокие дозы — 20 и 30 микрограмм на килограмм массы тела — не привели к когнитивному улучшению у макак, но и хуже не сделали. В отличие от обезьян, на мышей в предыдущих исследованиях высокие дозы белка действовали положительно. Возможно, слишком высокие дозы нарушают метаболизм у нечеловеческих приматов. Авторы предположили, что когнитивного улучшения у людей также можно будет достичь с помощью небольших, физиологических доз гормона. Также ученым еще предстоит выяснить, как сигналы белка передаются в мозг, поскольку введенный в кровь Клото сам не пересекает гематоэнцефалический барьер. Не так давно ученым удалось улучшить рабочую память людей, посветив на мозг лазером — через кожу и череп. До стимуляции люди могли запомнить 3–4 фигуры на картинке, а после — 4–5.