Новый метод окраски ДНК показал неупорядоченность хроматина в ядре

Программная обработка изображений, полученных при помощи электронной микротомографии (слева), позволяет оценить объемную концентрацию хроматина в участке ядра

Horng D. Ou et al / Science 2017

Специалисты из Университета Калифорнии (США) разработали новый метод окраски ДНК, который позволяет избирательно «разглядеть» хроматин — ДНК в комплексе с белками — в ядре при помощи электронной микроскопии. Благодаря усовершенствованному окрашиванию, исследователям удалось прямо в клетке изучить трехмерную структуру хроматина как в интерфазном ядре, так и в составе хромосом в процессе клеточного деления. Упорядоченных уровней упаковки хроматина, которые изображают в учебниках, ученые не нашли. Оказалось, что хроматин в ядре и в хромосомах на самом деле упакован «как попало». Исследование опубликовано в журнале Science.

Суммарная длина ДНК в клетке человека составляет около двух метров, а объем ядра, где она содержится, — несколько микрометров. Классическая модель, описанная в учебниках, предполагает, что ДНК содержится в ядре в упакованном виде. Начальный уровень компактизации представляет собой комплекс ДНК с белками-гистонами. Когда ДНК и гистоны объединяли в пробирке, они формировали структуру диаметром 11 нанометров, напоминающую бусы, где ДНК была через равные промежутки намотана на гистоновые комплексы. Предполагалось, что такая нить уложена в фибриллы диаметром 30 нанометров.

Для того чтобы в митозе из деконденсированного хроматина сформировать хромосомы, фибриллы должны последовательно упаковаться в 120-нанометровые структуры, затем в хроматиды диаметром 300 и 700 нанометров. Все эти структуры действительно наблюдали, однако в искусственных условиях — ДНК формирует их либо в растворе, либо в специально обработанных ядрах, из которых удалили все лишние компоненты.

Попытки «прижизненного» изучения ДНК в клетках давно заставили исследователей усомниться в устоявшейся модели, но существующие методы не позволяли изучать хроматин прямо в ядре. К примеру, криоэлектронная томография позволяет делать снимки клеточных структур с высоким разрешением, однако ДНК недостаточно контрастна на фоне окружающего льда. Электронная микроскопия уже применялась для изучения ультратонкой структуры хроматина, но она также требует контрастирования соединениями тяжелых металлов, которые плохо либо недостаточно селективно связываются с ДНК.  

Чтобы решить проблему контрастирования хроматина в клетке для последующего микроскопирования, специалисты из Национального центра микроскопии и исследования изображений университета Калифорнии разработали трехступенчатую схему окраски.

Ученые подобрали флуоресцентный краситель, специфично связывающийся с ДНК прямо в клетке, который при возбуждении создавал бы вокруг себя локальное повышение концентрации свободных радикалов. Этот эффект должен был поспособствовать полимеризации другого вещества, диаминобензидина, которым специально обрабатывали клетки. Получившаяся полимерная пленка на поверхности ДНК хорошо связывала оксид осмия —препарат, использующийся для контрастирования образцов в электронной микроскопии.

Таким образом, ученым удалось добиться селективного окрашивания ДНК, которое бы позволило с высоким разрешением «прижизненно» изучать хроматин.

В основном эксперименте исследователи обратились к электронной микротомографии (EMT). В окрашенных клетках эпителия и остеосаркомы человека были сделаны снимки множества слоев, которые затем объединили в трехмерное изображение. Так как метод получения изображения объединил селективное окрашивание хроматина и томографию, ученые назвали его ChromEMT.

Получившиеся 3D-модели ядер позволили не просто разглядеть нити хроматина, но и измерить их диаметр. Кроме того, компьютерная обработка изображений позволила рассчитать объемную концентрацию хроматина в разных участках интерфазного ядра (то есть в тот момент, когда клетка не делится) и непосредственно в хромосомах в процессе деления. Оказалось, что хроматин как в интерфазном ядре, так и в составе хромосом существует в виде нитей диаметром 5–12 и 12–24 нанометра.

Средний диаметр нитей составил 14 нанометров. Разные участки ядра отличались только концентрацией хроматина, которая не превышала 52 процента. В интерфазном ядре средняя концентрация хроматина составила 30 процентов, а в хромосоме — 42 процента. Нити могут формировать петли и скопления, но упорядоченных структур типа фибрилл они не образуют.

Для сравнения авторы работы взяли ядра клеток крови цыпленка, на которых часто проводятся исследования структуры хроматина, и подготовили их стандартным образом, то есть обработали солевым раствором. После этого ДНК в таких ядрах изучили методом ChromEMT. На изображениях действительно удалось детектировать 30-нанометровые фибриллы и другие структуры, соответствующие классической модели.

Для этого феномена может быть два объяснения, считают авторы: либо фибриллы являются артефактом пробоподготовки, либо структура хроматина в разных типах клеток существенно различается. В любом случае, «классическую» модель упаковки ДНК больше нельзя считать стандартной.

Неупорядоченная упаковка хроматина, которую обнаружили исследователи, лучше согласуется со всеми биохимическими функциями, которые выполняет ДНК. Отсутствие жестких структур позволяет как угодно сгибать нити без пространственных ограничений, что позволяет осуществлять любые дальние взаимодействия. В неупорядоченном виде проще обеспечить доступ различных модифицирующих ферментов, которые навешивают эпигенетические метки, к ДНК и гистонам. Кроме того, «хаотичная» структура хроматина позволяет очень быстрый переход из неактивного (гетерохроматин) в активное состояние.

Про то, как ученые прижизненно изучают активность хроматина и его эпигенетический статус, мы уже писали. Кроме того, мы рассказывали, как формируется гетерохроматин у дрозофилы и как российские ученые определили трехмерную структуру хромосом в оплодотворенной яйцеклетке.

Дарья Спасская


Нашли опечатку? Выделите фрагмент и нажмите Ctrl+Enter.