Описан механизм записи новой информации в CRISPR
Ученые из Калифорнийского университета в Беркли выяснили, каким образом в бактериальные CRISPR-системы, необходимые для защиты от инфекций и широко используемые в методах современной генной инженерии, встраиваются новые участки ДНК. Выяснилось, что для правильного и точного встраивания необходима кооперация интегразной системы Cas1-Cas2 и фактора IHF, причем ДНК при этом изгибается, подобно подкове, и ключевым фактором здесь является правильная геометрия механизма, а не точные нуклеотидные последовательности внутри кассеты CRISPR. Исследование опубликовано в Science.
CRISPR-кассета устроена следующим образом: это участок генома, содержащий серию повторов длинной 20-50 нуклеотидов, разделенных «спейсерами» — участками ДНК, например, вирусными, которые система использует как своего рода справочник при борьбе с инфекциями. Если попавшая в клетку ДНК похожа на то, что лежит в справочнике, специальные белки ее узнают и разрезают — это называют иммунным ответом бактериальной клетки.
Новые спейсеры вставляются в CRISPR с помощью интегразного комплекса, состоящего из 4 белков Cas1 и двух белков Cas2. Комплекс вставляет новый спейсер в начало кассеты, перед первым ее повтором, который следует за АТ-богатой лидерной последовательностью. Место, куда вставляется новый спейсер, должно выбрано правильно, потому что при встраивании ДНК в произвольный участок генома, кроме всего прочего, может произойти нарушение работы бактериальных генов.
Известно, что в CRISPR системах в процесса интеграции спейсеров участвуют лидерная последовательность, первый повтор и, в частности, инвертированный повторный GC-богатый участок внутри него. Фактор связывания IHF (Integration Host Factor), похожий на эукариотические гистоны, связывается с лидерной последовательностью и подключает к процессу Cas1-Cas2 комплекс. Ученые решили исследовать этот механизм, детали которого до сих пор были не ясны.
С помощью методов электронной микроскопии и рентгеноструктурной кристаллографии им удалось получить структуры комплексов интегразы и субстратной (инфекционной) и геномной ДНК на промежуточной и финальной стадиях процесса интеграции.
Выяснилось, что благодаря структуре кассеты (в частности, наличию в ней повторов), IHF может согнуть ее, подобно подкове, открывая при этом доступ интегразе к необходимым ей участкам. IHF связывается для этого с двумя сайтами. При этом непосредственного химического контакта (образования водородных связей) между интегразой и геномной ДНК почти не происходит, исключение составляют только несколько водородных связей в месте, где седьмая α-спираль Cas1 входит в малую бороздку спирали ДНК около лидерной последовательности. Основным фактором процесса интеграции являются, однако, не водородные связи, а именно правильная его геометрия, которая достигается за счет определенного расположения сайтов связывания белков и структуры ДНК самой кассеты. GC-богатый инвертированный повторный участок позволяет изогнуть ДНК, участок в середине первого повтора действует как дверная петля, а IHF держит всю эту конструкцию. Точного распознавания сайтов по нуклеотидам сам интегразный комплекс не осуществляет, что лишний раз подчеркивает неселективную природу траспозазы Cas1, описанную во многих исследованиях.
Оказалось также, что при отсутствии IHF гораздо чаще происходит встраивание субстратной ДНК в произвольные участки бактериального генома. При перенесении участка его связывания на пять нуклеотидов в сторону такого не происходит, но снижается эффективность интеграции. Таким образом, правильное взаимодействие IHF и интегразного комплекса Cas1-Cas2 оказывается ключевым для точного и эффективного встраивания новых спейсеров в кассету CRISPR.
При этом, как уже говорилось выше, интегразному комплексу важна структура объекта, куда он будет встраивать новые последовательности, но не конкретные нуклеотидные последовательности внутри него. Возможно, именно с этой особенностью связано огромное разнообразие CRISPR-кассет в бактериях. Ученые считают, что подобный уникальный механизм интегразного комплекса Cas1-Cas2 можно использовать в качестве "молекулярного записывающего устройства" для баркодирования геномов или для нестандартных локус-специфичных встроек.
А о том, как с помощью системы CRISPR создали помидоры, не нуждающиеся в опылении, можно почитать
.
Анна Казнадзей
Благодаря лекарствам гормоны перестали мешать иммунитету бороться с опухолью
Японские ученые описали механизм, благодаря которому лекарства, блокирующие работу эстрогенов, подавили развитие опухолей, не имеющих альфа-рецепторов к эстрогенам. Анализ данных от пациенток с трижды негативным раком молочной железы и эксперименты на мышах показали, что антиэстрогенные препараты снижают иммуносуппрессивное действие эстрогенов в отношении противоопухолевых цитотоксических лимфоцитов. Использование антиэстрогенных препаратов у мышей с опухолями, нечувствительными к эстрогенам, помогло замедлить рост опухолей. Исследование опубликовано в журнале British Journal of Cancer. Эстрогены называют женскими половыми гормонами, но они влияют не только на созревание и работу женской половой системы, но и практически на все органы и системы мужского и женского организма, включая мозг, эпителии, костную ткань и иммунную систему. В эпителиальных клетках молочных желез и женской половой системы есть альфа-рецепторы к эстрогенам, регулирующие рост и дифференцировку в разные фазы менструального цикла. Такие же рецепторы есть и во многих опухолевых клетках: примерно три четверти раков молочной железы экспрессируют альфа-рецепторы, а блокада рецепторов и блокада выработки эстрогенов лежат в основе лечения пациенток (и пациентов). В течение последних 30 лет появляются наблюдения, согласно которым опухоли молочной железы, не экспрессирующие альфа-рецепторы, иногда тоже реагируют на лечение антиэстрогенными препаратами, но механизм этого феномена оставался неясен. Иммунологи и биоинформатики из Университета Хоккайдо во главе с Кэн-итиро Сэйно (Ken-ichiro Seino) описали механизм действия антиэстрогенных препаратов на опухоли, лишенные альфа-рецепторов. Для начала они оттолкнулись от датасета TCGA, в котором содержалась информация о транскриптоме трижды негативного рака молочной железы у 171 пациентки. Ученые выяснили, что чем выше активность гена HSD17B1 в опухоли (ген кодирует фермент, превращающий малоактивный гормон эстрон в активный гормон эстрадиол), тем меньше в опухолевых массах цитотоксических Т-лимфоцитов (r = −0,299, p = 0,00006). У пациенток с высокой экспрессией фермента болезнь протекала агрессивнее. Ученые смоделировали на мышах, как влияет высокий уровень эстрогенов на противоопухолевый иммунитет. Они вводили самкам мышей опухолевые клетки из двух линий, не имеющих альфа-рецепторов к эстрогенам (мышиный трижды негативный рак молочной железы и мышиный колоректальный рак). Половине животных ученые удалили яичники перед введением клеток. У таких мышей уровень эстрогенов был ниже, чем в контрольной группе, но выживаемость была лучше, а опухоли росли медленнее. Если мышам с опухолями и нормально функционирующими яичниками вводить препараты, подавляющие образование эстрогенов (анастрозол) или блокирующие альфа-рецепторы (тамоксифен, фульвестрант), то количество цитотоксических лимфоцитов в опухоли становилось выше, причем эффект не был связан с дополнительными рецепторами к гормонам, которые часто обнаруживают у трижды негативного рака. Лимфоциты, инфильтрирующие опухоль, становились активнее под действием лекарств: в опухоли повышался уровень интерферона гамма и цитотоксических молекул, вырабатываемых активированными лимфоцитами. Когда ученые попытались лечить мышей с трижды негативным раком молочной железы комбинацией химиопрепаратов и фульвестранта, то добавление антиэстрогенной терапии снижало скорость прогрессирования опухоли в 2,5-5 раз. Эксперименты на культуре клеток показали, что активация рецепторов к эстрогенам на лимфоцитах снижает их противоопухолевую активность — подавляет выработку клетками интерлейкина второго типа и активность сигнального пути JAK-STAT (о том, какое отношение он имеет к воспалению, мы рассказывали на примере мышечной ткани). Работа ученых из Университета Хоккайдо показывает: если у давно известного лекарства нет мишени в опухолевых клетках, то это не значит, что лекарство не будет эффективным. Плейотропные эффекты антигормональных препаратов могут быть полезны в иммуноонкологии, но пока рано говорить о том, что связь между эстрогенами и противоопухолевым иммунитетом окончательно расшифрована (в ряде случаев она, видимо, и вовсе работает в противоположном направлении). Тем не менее некоторые антиэстрогенные препараты уже целенаправленно исследуют в лечении эстрогеннегативных опухолей. В онкологии много примеров, когда врачи извлекают пользу из лекарства, которое на первый взгляд не должно было работать. Один из самых ярких примеров — талидомид, у которого в последнее время находят все больше положительных эффектов. О нелегкой судьбе соединения читайте в материале «Готов искупить».