Описан механизм записи новой информации в CRISPR
Первичные этапы взаимодействия интегразного комплекса, принесшего "чужую" ДНК, и CRISPR-кассеты
Addison V. Wright et al / Science, 2017
Ученые из Калифорнийского университета в Беркли выяснили, каким образом в бактериальные CRISPR-системы, необходимые для защиты от инфекций и широко используемые в методах современной генной инженерии, встраиваются новые участки ДНК. Выяснилось, что для правильного и точного встраивания необходима кооперация интегразной системы Cas1-Cas2 и фактора IHF, причем ДНК при этом изгибается, подобно подкове, и ключевым фактором здесь является правильная геометрия механизма, а не точные нуклеотидные последовательности внутри кассеты CRISPR. Исследование опубликовано в Science.
CRISPR-кассета устроена следующим образом: это участок генома, содержащий серию повторов длинной 20-50 нуклеотидов, разделенных «спейсерами» — участками ДНК, например, вирусными, которые система использует как своего рода справочник при борьбе с инфекциями. Если попавшая в клетку ДНК похожа на то, что лежит в справочнике, специальные белки ее узнают и разрезают — это называют иммунным ответом бактериальной клетки.
Новые спейсеры вставляются в CRISPR с помощью интегразного комплекса, состоящего из 4 белков Cas1 и двух белков Cas2. Комплекс вставляет новый спейсер в начало кассеты, перед первым ее повтором, который следует за АТ-богатой лидерной последовательностью. Место, куда вставляется новый спейсер, должно выбрано правильно, потому что при встраивании ДНК в произвольный участок генома, кроме всего прочего, может произойти нарушение работы бактериальных генов.
Известно, что в CRISPR системах в процесса интеграции спейсеров участвуют лидерная последовательность, первый повтор и, в частности, инвертированный повторный GC-богатый участок внутри него. Фактор связывания IHF (Integration Host Factor), похожий на эукариотические гистоны, связывается с лидерной последовательностью и подключает к процессу Cas1-Cas2 комплекс. Ученые решили исследовать этот механизм, детали которого до сих пор были не ясны.
С помощью методов электронной микроскопии и рентгеноструктурной кристаллографии им удалось получить структуры комплексов интегразы и субстратной (инфекционной) и геномной ДНК на промежуточной и финальной стадиях процесса интеграции.
Выяснилось, что благодаря структуре кассеты (в частности, наличию в ней повторов), IHF может согнуть ее, подобно подкове, открывая при этом доступ интегразе к необходимым ей участкам. IHF связывается для этого с двумя сайтами. При этом непосредственного химического контакта (образования водородных связей) между интегразой и геномной ДНК почти не происходит, исключение составляют только несколько водородных связей в месте, где седьмая α-спираль Cas1 входит в малую бороздку спирали ДНК около лидерной последовательности. Основным фактором процесса интеграции являются, однако, не водородные связи, а именно правильная его геометрия, которая достигается за счет определенного расположения сайтов связывания белков и структуры ДНК самой кассеты. GC-богатый инвертированный повторный участок позволяет изогнуть ДНК, участок в середине первого повтора действует как дверная петля, а IHF держит всю эту конструкцию. Точного распознавания сайтов по нуклеотидам сам интегразный комплекс не осуществляет, что лишний раз подчеркивает неселективную природу траспозазы Cas1, описанную во многих исследованиях.
IHF загибает ДНК в подковообразную структуру, после чего происходит взаимодействие Cas1 со своими сайтами
Addison V. Wright et al / Science, 2017
Оказалось также, что при отсутствии IHF гораздо чаще происходит встраивание субстратной ДНК в произвольные участки бактериального генома. При перенесении участка его связывания на пять нуклеотидов в сторону такого не происходит, но снижается эффективность интеграции. Таким образом, правильное взаимодействие IHF и интегразного комплекса Cas1-Cas2 оказывается ключевым для точного и эффективного встраивания новых спейсеров в кассету CRISPR.
При этом, как уже говорилось выше, интегразному комплексу важна структура объекта, куда он будет встраивать новые последовательности, но не конкретные нуклеотидные последовательности внутри него. Возможно, именно с этой особенностью связано огромное разнообразие CRISPR-кассет в бактериях. Ученые считают, что подобный уникальный механизм интегразного комплекса Cas1-Cas2 можно использовать в качестве "молекулярного записывающего устройства" для баркодирования геномов или для нестандартных локус-специфичных встроек.
А о том, как с помощью системы CRISPR создали помидоры, не нуждающиеся в опылении, можно почитать
.
Анна Казнадзей
Благодаря лекарствам гормоны перестали мешать иммунитету бороться с опухолью
Японские ученые описали механизм, благодаря которому лекарства, блокирующие работу эстрогенов, подавили развитие опухолей, не имеющих альфа-рецепторов к эстрогенам. Анализ данных от пациенток с трижды негативным раком молочной железы и эксперименты на мышах показали, что антиэстрогенные препараты снижают иммуносуппрессивное действие эстрогенов в отношении противоопухолевых цитотоксических лимфоцитов. Использование антиэстрогенных препаратов у мышей с опухолями, нечувствительными к эстрогенам, помогло замедлить рост опухолей. Исследование опубликовано в журнале British Journal of Cancer. Эстрогены называют женскими половыми гормонами, но они влияют не только на созревание и работу женской половой системы, но и практически на все органы и системы мужского и женского организма, включая мозг, эпителии, костную ткань и иммунную систему. В эпителиальных клетках молочных желез и женской половой системы есть альфа-рецепторы к эстрогенам, регулирующие рост и дифференцировку в разные фазы менструального цикла. Такие же рецепторы есть и во многих опухолевых клетках: примерно три четверти раков молочной железы экспрессируют альфа-рецепторы, а блокада рецепторов и блокада выработки эстрогенов лежат в основе лечения пациенток (и пациентов). В течение последних 30 лет появляются наблюдения, согласно которым опухоли молочной железы, не экспрессирующие альфа-рецепторы, иногда тоже реагируют на лечение антиэстрогенными препаратами, но механизм этого феномена оставался неясен. Иммунологи и биоинформатики из Университета Хоккайдо во главе с Кэн-итиро Сэйно (Ken-ichiro Seino) описали механизм действия антиэстрогенных препаратов на опухоли, лишенные альфа-рецепторов. Для начала они оттолкнулись от датасета TCGA, в котором содержалась информация о транскриптоме трижды негативного рака молочной железы у 171 пациентки. Ученые выяснили, что чем выше активность гена HSD17B1 в опухоли (ген кодирует фермент, превращающий малоактивный гормон эстрон в активный гормон эстрадиол), тем меньше в опухолевых массах цитотоксических Т-лимфоцитов (r = −0,299, p = 0,00006). У пациенток с высокой экспрессией фермента болезнь протекала агрессивнее. Ученые смоделировали на мышах, как влияет высокий уровень эстрогенов на противоопухолевый иммунитет. Они вводили самкам мышей опухолевые клетки из двух линий, не имеющих альфа-рецепторов к эстрогенам (мышиный трижды негативный рак молочной железы и мышиный колоректальный рак). Половине животных ученые удалили яичники перед введением клеток. У таких мышей уровень эстрогенов был ниже, чем в контрольной группе, но выживаемость была лучше, а опухоли росли медленнее. Если мышам с опухолями и нормально функционирующими яичниками вводить препараты, подавляющие образование эстрогенов (анастрозол) или блокирующие альфа-рецепторы (тамоксифен, фульвестрант), то количество цитотоксических лимфоцитов в опухоли становилось выше, причем эффект не был связан с дополнительными рецепторами к гормонам, которые часто обнаруживают у трижды негативного рака. Лимфоциты, инфильтрирующие опухоль, становились активнее под действием лекарств: в опухоли повышался уровень интерферона гамма и цитотоксических молекул, вырабатываемых активированными лимфоцитами. Когда ученые попытались лечить мышей с трижды негативным раком молочной железы комбинацией химиопрепаратов и фульвестранта, то добавление антиэстрогенной терапии снижало скорость прогрессирования опухоли в 2,5-5 раз. Эксперименты на культуре клеток показали, что активация рецепторов к эстрогенам на лимфоцитах снижает их противоопухолевую активность — подавляет выработку клетками интерлейкина второго типа и активность сигнального пути JAK-STAT (о том, какое отношение он имеет к воспалению, мы рассказывали на примере мышечной ткани). Работа ученых из Университета Хоккайдо показывает: если у давно известного лекарства нет мишени в опухолевых клетках, то это не значит, что лекарство не будет эффективным. Плейотропные эффекты антигормональных препаратов могут быть полезны в иммуноонкологии, но пока рано говорить о том, что связь между эстрогенами и противоопухолевым иммунитетом окончательно расшифрована (в ряде случаев она, видимо, и вовсе работает в противоположном направлении). Тем не менее некоторые антиэстрогенные препараты уже целенаправленно исследуют в лечении эстрогеннегативных опухолей. В онкологии много примеров, когда врачи извлекают пользу из лекарства, которое на первый взгляд не должно было работать. Один из самых ярких примеров — талидомид, у которого в последнее время находят все больше положительных эффектов. О нелегкой судьбе соединения читайте в материале «Готов искупить».