Созданы дрожжи с искусственными хромосомами

Крупная международная коллаборация биологов рассказала о завершении работы над 6 из 16 синтетических хромосом дрожжей. Ученым удалось не только химически синтезировать треть генома первого ядерного организма, но и немного «подчистиить» и компактизовать этот геном, а также внести изменения, облегчающие дальнейшие манипуляции с «синтетическими дрожжами». Отчет об исследовании и результаты работы опубликованы в пяти статьях, вышедших в специальном номере журнала Science.

Значительное падение стоимости химического синтеза ДНК за последние 20-30 лет открыло для биологов потенциальную возможность не только проводить точечные вмешательства в геном обычными методами генной инженерии, но и переписывать геномы «с нуля». Такой подход позволяет вносить в ДНК гораздо более глобальные и глубокие изменения. Например, таким образом можно полностью вырезать «мусорные» или нежелательные последовательности, перегруппировать гены, расставить специальные метки вдоль ДНК для облегчения последующих манипуляций или даже глобально модифицировать генетический код.

Подобные работы относят к области т. н. «синтетической биологии», которая ставит перед собой задачу разработки системы генетических «запасных частей» и рационального дизайна на их основе новых синтетических организмов. Некоторые успехи в этом направлении уже есть: еще в 2003 году команде Крейга Вентера удалось собрать первый полностью синтетический геном вируса (бактериофага φX174), в 2010 году те же исследователи синтезировали геном бактерии Mycoplasma mycoides, а в марте прошлого года биологи представили «минимальную» версию этого организма, из которой были выброшены почти все «лишние» последовательности. Однако нынешние успехи в технологии синтеза и сборки геномов пока опережают прогресс в понимании механизмов их работы. Так, в геноме того же минимального синтетического Mycoplasma mycoides есть 149 (из 473) обязательных для жизни генов, функция которых до сих пор полностью неизвестна. Причем речь здесь идет именно об отсутсвии проверенных знаний о функциях самих генов, что же касается механизмов регуляции их работы или организации некодирующих последовательностей в геноме, то об этом авторы «искусственной жизни» знают еще меньше. Тем не менее, даже происходящее на данном этапе простое «списывание у природы» способно дать принципиально новую биологическую информацию, которая будет незаменима для последующего рационального моделирования живых систем.

Международная коллаборация Sc2.0, статьи которой вышли в специальном выпуске Science, ставит себе задачу технически даже более амбициозную, чем последний проект Института Вентера. Речь идет о полном синтезе генома пекарских дрожжей, — а в нем умещается почти вдесятеро больше генов, чем в минимизированной версии микоплазмы. Выбор именно дрожжей в качестве цели проекта объясняется тем, что, во-первых, из всех ядерных организмов у них один из самых маленьких геномов (сравнительная таблица имеется, например, здесь), во-вторых, дрожжи это хорошо изученная и удобная для манипуляций модельная система и, в-третьих, важность дрожжей для экономики сложно сопоставить с каким-либо другим микроорганизмом. Кроме того, здесь следует отметить, что организация генома, возможности синтеза белков и вообще строение клетки у бактерий и эукариот очень существенно отличаются. Поэтому синтетические работы, которые идут в том и другом направлениях во многом независимы друг от друга и в технологиях, и в результатах, хотя и основаны на одном и том же фундаменте — химическом синтезе олигонуклеотидов.

Работы по созданию «искусственных дрожжей» в проекте Sc2.0 разбиты среди исследовательских центров по отдельным хромосомам. Синтез происходит следующим образом: олигонуклеотиды собирают с помощью ПЦР в кусочки размером по 10 тысяч нуклеотидов, затем их сшивают друг с другом в «мегакусочки» длиной в 3-6 раз больше. Эти «мегакусочки», каждый из которых несет специальный (ауксотрофный) маркер для отбора на селективной среде, затем вставляют в дрожжевой геном. Уникальное свойство дрожжей, которое существенно облегчает внесение изменений в их геном заключается в том, что клеткам дрожжей достаточно наличия гомологичных последовательностей на концах фрагмента ДНК, чтобы вставить этот фрагмент в геном в ходе гомологичной рекомбинации. Если вставленный фрагмент будет нести ген синтеза необходимой дрожжам аминокислоты (которой нет в среде), то на чашке вырастут только такие клетки, в которых привнесенный фрагмент успешно встроился в геном. Постепенно вводя в геном по одному «мегакусочку» ученым на данный момент удалось полностью заменить на искусственные копии шесть с половиной из 16 хромосом гомологичного набора дрожжей. Пока каждая из этих хромосом «живет» отдельно в своем штамме, но ученые уже испытали метод их объединения в полностью искусственный набор.

Что касается изменений, которые отличают искусственный геном, то их можно разделить на несколько групп. Во-первых, это технические улучшения: ученые расставили вдоль генома сайты посадки эндонуклеаз, позволяющие удобно манипулировать ДНК, ввели набор маркеров, которые позволяют контролировать ход сборки генома по ПЦР и добавили серию сайтов для Cre-рекомбиназы, которая позволяет точечно вырезать любые интересующие исследователей гены. Во-вторых, это изменения самого генетического кода: из всего нового генома ученые удалили один из стоп-кодонов, в результате чего появился совершенно свободный триплет, который можно использовать, например, для введения в белки искусственных аминокислот. В-третьих, изменения касались оптимизации: из генома были удалены повторы, лишние гены транспортной РНК и почти все интроны (у дрожжей, в отличие от других эукариот, интронов почти и нет). Все эти изменения были спланированы и организованы заранее, для чего консорциуму понадобилось создать специальную программную среду, BioStudio, выпущенную под свободной лицензией. 

В настоящее время последовательность всего генома уже просчитана, методика сборки из фрагментов опробована и идет техническая работа по синтезу оставшихся двух третей генома. Его общий размер должен составить 11,35 миллиона нуклеотидов — чуть меньше, чем природный 12-милионный геном. Подробнее о методах и успехах синтетической биологии можно прочитать здесь. 

Александр Ершов