Моль съела результаты

В сентябре в журнале Nature вышла работа норвежских ученых — не исследование и не обзор, а рассуждение о перспективах целой области полимерной химии — биоразложения негидролизуемых пластиков. Подобные эксперименты крайне важны, ведь в перспективе они помогут справиться с пластиковым загрязнением. Однако пока картина не очень радужна: результаты плохо воспроизводятся, а ученые из разных групп регулярно спорят друг с другом. Вместе с авторами новой работы разбираемся, почему одни пластики хорошо растворяются под действием ферментов, а другие нет, какими методами можно «засечь» очень медленный процесс разложения, и почему публиковать отрицательные результаты тоже важно.

История успеха с ПЭТ

В апреле 2020 года, пока все следили за новостями о коронавирусе, в журнале Nature вышла статья французских химиков из Университета Тулузы и компании Carbios. Авторы работы усовершенствовали природный кутиназу компостного листа так, что он мог гидролизовать не только листья, но и полиэтилентерефталат (ПЭТ). Всего за десять часов реакции при температуре 72 градуса Цельсия они смогли разложить 90 процентов ПЭТ (18 из 20 килограмм) до соответствующих мономеров — этиленгликоля и терефталевой кислоты.

Это исследование не было первым случаем пластика (такие работы появились еще в начале века), однако в плане эффективности стало настоящим прорывом. Работу французов процитировали более двух тысяч раз, а несколько компаний воспроизвели ферментативный гидролиз ПЭТ за пределами лабораторий. Впрочем, на кутиназе компостного листа дело не закончилось. Ученые искали новые эффективные ферменты — кутиназы, гидролазы и пэтазы — в самых загрязненных местах планеты и доводили формулы до совершенства с помощью алгоритмов машинного обучения. Более того, оказалось, что перерабатывать ПЭТ могут некоторые бактерии и даже грибы (в этих случаях ферменты тоже участвуют в разложении, просто не всегда удается понять, какие именно).

Так что же, получается, мы уже близки к быстрой и эффективной переработке всего на свете пластика?

Увы, это не так. Для полиэтилена, полипропилена и полистирола описанный выше ферментативный гидролиз не работает сейчас и точно не заработает в будущем. В цепях этих полимеров просто нечего гидролизовать: нет сложноэфирных мостиков, которые атакуют гидролазы и кутиназы. Вся цепь таких полимеров состоит из одинаковых связей углерод-углерод — прочных, неполярных, самых труднорвущихся связей в полимерных молекулах. Именно поэтому их называют .

Кто прогрыз пакет

Однако гидролиз — не единственный вариант биоразложения. Чтобы порвать прочные углеводородные цепи, в ход пошли оксидазы и другие окисляющие ферменты, консорциумы бактерий и даже насекомых. Вот только по сравнению с гидролизом ПЭТ эти исследования как будто топтались на месте. 

Особенно известной стала история с личинками восковой моли Galleria mellonella. Впервые о них написали китайские ученые в 2014 году, а тремя годами позже испанские и британские исследователи под руководством Федерики Берточини (Federica Bertocchini) продемонстрировали, что эти личинки прогрызают полиэтиленовые пакеты. За несколько часов сотня гусениц смогла заметно уменьшить массу пленки, а в продуктах их жизнедеятельности обнаружили этиленгликоль. В природе личинки Galleria mellonella питаются пчелиным воском, богатым длинноцепочечными углеводородами, так что ученые предположили, что их пищеварительная система могла приспособиться к перевариванию полиэтилена. Фотографии пакета с дырами, проделанными молью, тогда всех впечатлили, но в том же году немецкие химики указали, что химический механизм процесса не ясен, и нельзя однозначно утверждать, что гусеницы переварили полиэтилен, а не просто его погрызли.

Авторы частично признали справедливость претензий, и на какое-то время об истории с гусеницами забыли. Однако Фредерика Берточчини не была готова признать поражение: к 2022 году ее группа уже без британских соавторов выделила слюну гусениц и показала, что она окисляет и деполимеризует полиэтилен даже без жевания. Доказательств в этот раз было больше, но убедить научное сообщество все равно не получилось. Например, в 2024 году вышла статья с красноречивым заголовком: «Polyethylene and related hydrocarbon polymers ("plastics") are not biodegradable», где результаты испанцев вновь поставили под сомнение.

Деградирует или нет

Разобраться в хаосе результатов и выяснить, действительно ли негидролизуемый пластик деградирует, попробовали норвежские, немецкие, корейские и американские химики под руководством Густава Ваае‑Кольстада (Gustav Vaaje-Kolstad) из Норвежского университета естественных наук. Ученые проанализировали массив работ по разложению негидролизуемых пластиков. Оказалось, что вопрос надо ставить шире: а как вообще понять, что пластик деградирует? 

На первый взгляд, этот вопрос кажется простым и вообще не возникает, если разложилось 90 или хотя бы 9 процентов материала: все будет видно невооруженным глазом. Но если растворилось 0,9 или 0,09 процента, ситуация становится сложнее. На вид кусочек пластика почти не изменится, поэтому придется использовать более чувствительные методы. Кроме того, как показали озвученные сомнения в эффективности моли, механическое разрушение тоже не обязательно указывает на то, что пластик именно разложился.

Можно работать непосредственно с материалом — взвешивать его и изучать поверхность. А можно попытаться проследить путь отделившихся от него веществ: если использовался чистый фермент, то они окажутся в растворе; если в разложении участвовали живые бактерии, насекомые или грибы, то надо искать внутри них либо в продуктах их жизнедеятельности. В арсенале ученых множество методов, которые могут засечь даже следовые количества веществ. Но, по мнению Ваае‑Кольстада и его коллег, здесь возникает еще одна проблема: чем чувствительней метод, тем больше ложноположительных сигналов он находит.

Самый простой способ посмотреть, что произошло с поверхностью материала, — инфракрасная спектроскопия с нарушенным полным внутренним отражением (ИК). Она показывает, какие химические группы есть на поверхности. Например, если в полиэтилене появились кислородсодержащие группы, это укажет на окисление. Однако такие же группы есть в белках, липидах и полисахаридах из ферментного препарата. Особенно коварны пептидные связи: их сигналы могут выглядеть очень похоже на признаки изменений самого полиэтилена. Избавиться от пептидов обычно пытаются с помощью тщательной промывки образца. Но и здесь нет полной гарантии: если после нескольких промывок сигнал перестал уменьшаться, это еще не означает, что он принадлежит окисленному пластику — возможно, просто достигнут предел эффективности самой процедуры очистки. То же можно сказать о других методах анализа поверхности — рамановской спектроскопии, рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии и измерению краевого угла смачивания.

Микроскопия дает более наглядную картинку рельефа: трещины, ямки и другие повреждения. Но пластик можно повредить механически — например, при перемешивании или обработке ультразвуком, — и на микрофотографии такое повреждение будет выглядеть почти так же, как результат работы фермента. Кроме того, все поверхностные методы «захватывают» только маленькие участки образца. Поэтому коллектив под руководством Ваае‑Кольстада не советует использовать такие методы как основной способ доказательства.

Чтобы проанализировать, что случилось с самим полимером, используют эксклюзионную или гель-проникающую хроматографию. Образец окончательно разламывают, погружают в органический растворитель и пропускают через колонку — в ней вещества разделяются в зависимости от размера. 

Если фермент действительно разрезал цепи полимера, после обработки в образце должно стать больше коротких молекул, а распределение молярных масс — сместиться в сторону меньших значений. Но и хроматография не всесильна. Если фермент воздействует только на небольшую долю поверхности, средняя молярная масса всего образца может практически не измениться. А продукты реакции — вообще исчезнуть из образца до анализа: раствориться, вымыться или быть съеденными микроорганизмами. Кроме того, биологические образцы сами могут содержать вещества, которые на хроматограммах будут выглядеть как низкомолекулярные продукты его распада. Поэтому для корректных результатов нужны дополнительные контрольные образцы — например, тот же самый ферментный препарат, обработанный тем же растворителем, но без пластика.

Все, что было, все, что сплыло

Еще один классический метод — просто взвесить пластик до и после эксперимента. Если его масса уменьшилась, это прямое доказательство деградации. Именно так когда-то было показано действие первого фермента, расщепляющего ПЭТ.

Для полиэтилена и других устойчивых полимеров такой эксперимент гораздо сложнее. Если потеря массы составляет доли процента, ее легко спутать с потерями материала при переносе или промывке. Поэтому контрольный образец должен проходить абсолютно те же процедуры, что и экспериментальный. Например, если после опыта с бактериями пластик промывают и обрабатывают ультразвуком, то точно так же нужно обработать контрольный образец. Ваае‑Кольстад и его коллеги также рекомендуют использовать пленки или листы, а не порошки: их проще полностью собрать после эксперимента и точно взвесить.

Но у взвешивания есть и другая проблема: оно показывает только, что материал куда-то делся. Чтобы понять, куда именно, нужно искать продукты реакции.

Здесь в игру вступает масс-спектрометрия. Обычно продукты сначала разделяют с помощью газовой или жидкостной хроматографии, а затем идентифицируют по масс-спектру — поэтому такие методы называют GC–MS и LC–MS. Современные масс-спектрометры чрезвычайно чувствительны и позволяют обнаруживать ничтожные количества веществ. Если фермент действительно разрезает полиэтиленовую цепь, то в спектре будут видны низкомолекулярные «обрывки».

У масс-спектрометрии есть важное преимущество перед ИК: химическую структуру обнаруженного соединения зачастую можно установить гораздо точнее. Для GC–MS, например, спектр неизвестного вещества можно автоматически сравнить с библиотекой. Однако чувствительность масс-спектрометрии создает новую проблему. В коммерческом пластике много низкомолекулярных добавок и примесей. Ферменты могут разрушаться, а уж если в эксперименте были задействованы бактерии и насекомые, то и вовсе пиши пропало: в спектре обнаружатся десятки соединений, никак не связанных с разложением пластика.

При этом избавиться от главной неопределенности можно: нужно просто заранее пометить сам пластик. Например, вместо обычного полиэтилена взять полиэтилен, в котором атомы углерода-12 частично заменены на более тяжелый изотоп углерода-13. Тогда, если фермент или микроорганизм действительно разрушает полимер, можно проследить судьбу именно его углерода.

Это особенно важно в экспериментах с живыми организмами: если полиэтилен был мечен углеродом-13 и тот же изотоп обнаруживается в клеточных молекулах, например в липидах мембраны, связь становится гораздо надежнее. Например, ¹³C-сигнал обнаружили в мембранных липидах бактерии Rhodococcus ruber, выращенной с предварительно окисленным меченым полиэтиленом.

У метода есть только один, но весьма существенный недостаток — цена. Ваае‑Кольстад приводит цену более 15 тысяч долларов за грамм. Синтезировать меченый полимер самостоятельно из изотопно-меченых исходных веществ может быть чуть дешевле, но сложнее, к тому же это возвращает нас к проблеме распределения молярных масс.

Вернемся к нашим гусеницам

Теперь можно посмотреть на историю с восковой молью через призму этих методов. В работе 2017 года авторы оценили потерю массы полиэтилена, изучили его поверхность с помощью ИК и микроскопии и обнаружили вещества, которые интерпретировали как продукты распада. Их критики указали, что потеря массы могла быть связана с механическим разрушением (жеванием), а сигналы ИК — с прилипшими белками и липидами из организма гусениц. Для убедительного доказательства не хватало, в частности, подходящих контролей и изотопной метки.

В 2022 году арсенал методов был уже серьезнее: авторы обнаружили изменения поверхности полиэтилена с помощью спектроскопии, небольшую низкомолекулярную фракцию с помощью гель-проникающей хроматографии и окисленные продукты с помощью GC–MS. Более того, хроматография показала, что после 15 обработок средняя молекулярная масса полиэтилена уменьшилась примерно с 207100 до 199500 дальтон — примерно на 3,7 процента. Из слюны исследователи также выделили два белка, которые воспроизводили некоторые из этих эффектов. 

Но и к этой работе нашлись вопросы. В 2024 году химик Дитер Йендроссек (Dieter Jendrossek) указал, что большинство результатов остаются косвенными: изменение молярной массы было небольшим, а для GC–MS-эксперимента, по его мнению, не хватало контроля с денатурированными белками. Поэтому из этих данных нельзя уверенно заключить, что гусеницы действительно превращают значительную часть полиэтилена в продукты его метаболизма. Надежнее всего было бы провести эксперимент с изотопно-меченым полиэтиленом и проследить судьбу его углерода.

Впрочем, даже если результат с изотопными метками появится, до такого успеха, как с ПЭТ, все равно будет далеко — более того, вполне возможно, этого вообще никогда и не случится. Невольно возникает неприятный вопрос: может быть, пора признать, что прямой ферментативный путь для углеводородного пластика ведет в тупик? Возможно, лучшим выходом будет сокращать использование таких материалов либо заменять их на ПЭТ, тем более что с его разложением все по-честному получается.

С другой стороны, посвященные биоразложению ПЭТ исследования тоже некоторое время топтались на месте. Может быть, и с полиэтиленом в конце концов ученых ожидает прорыв. Сам Ваае-Кольстад настроен более-менее оптимистично и не предлагает отказываться от ферментативного разложение полиэтилена. Пока он всего лишь призывает коллег изменить подход: лучше стандартизировать эксперименты и проверять спорные результаты. Будем следить за новыми публикациями.