Что мы узнали о клонировании за 30 лет
В 1931 году Олдос Хаксли опубликовал антиутопию «Дивный новый мир». По сюжету книги в жутком будущем клонирование поставлено на поток: расщепление методом Бокановского позволяло выращивать из одной оплодотворенной яйцеклетки почти сотню идентичных людей. За этим, одним из самых ранних художественных описаний процесса клонирования, последовали другие: в «Парке Юрского периода» клонировали динозавров, в «Дюне» создавали гхолу Дункана Айдахо, во втором сезоне сериала «Доктор Кто» крайне недолговечные копии Четвертого доктора и его спутницы Лилы были созданы по образцам ДНК. В подавляющем большинстве фантастических миров клонирование, пусть и завораживало, но ничего хорошего не предвещало. Поэтому когда в 1997 году шотландские ученые сообщили, что 5 июля 1996 года родилась клонированная овечка Долли, новость встретили с равной долей восторга и смятения. Рассказываем, что нового мы узнали о клонировании за 30 лет с момента ее рождения.
Самый популярный способ создать клона — соматический перенос ядер. В очищенную от ядра яйцеклетку впрыскивают обычную клетку с ядром и пускают разряд тока, чтобы из получившегося гибрида начал развиваться эмбрион. Затем подросший в культуре эмбрион подсаживают суррогатной матери и ждут появления на свет клона (подробнее про этот и другие способы клонирования мы писали в тексте «Здравствуй, гхола»).
Метод переноса ядер придумали британские биологи Роберт Бриггс и Томас Кинг в 1952 году, когда пересадили в яйцеклетку леопардовой лягушки ядра из эмбрионов другой лягушки. Из 197 гибридов примерно 15 эмбрионов выжили и прошли нормальный путь развития до головастика. Вскоре стало понятно, что в клонировании совершенно не обязательно использовать юные зародышевые ядра: если пересадить ядра от взрослой особинапример от кератиноцитов, клоны тоже дорастают до стадии головастика. Впрочем, развитие взрослой лягушки в экспериментах с клонированием все же происходило катастрофически редко: даже если пересаживали ядро от зародыша или юного головастика, а не взрослой особи, в среднем только пять процентов яиц превращались половозрелых лягушек.
Возможно, именно это несколько убаюкивало общество: головастик — еще не взрослая лягушка; амфибия — еще не млекопитающее; пересадить ядро от зародыша или личинки — не то же самое, что от взрослого организма; вырастить головастика — проще, чем выносить клон плацентарного животного; а лягушки все равно все на одно лицо.
Утешительные аргументы отпали в 1990-х годах, когда исследователям из Рослинского института клонировали овечек с помощью переноса «юных» ядер от зародышевых клеток и фибробластов плода, а затем и при переносе «зрелых» ядер из эпителия молочной железы взрослой овцы. Так появилось восемь клонов овечек: четыре из зародышевых ядер (ягнята 6LL1, 6LL2, 6LL5, 6LL6), три из фетальных фибробластов (6LL7, 6LL8, 6LL9) и один — из клеток молочной железы, ягненок 6LL3, больше известный как Долли. У Долли было три мамы: культура клеток, из которой взяли генетический материал; донор яйцеклетки и суррогатная мама.
Долли стала первым клоном млекопитающего, который появился с помощью переноса ядра из ткани взрослого животного. Ее рождение доказало, что при дифференцировке клеток в зрелое состояние необратимых изменений генетической информации не происходит, а значит из клеток, взятых от взрослого существа, можно сделать его жизнеспособную генетическую копию.
Этот успех, впрочем, дался нелегко: восемь клонов овечек получились из 834 переносов ядер, на появление одной Долли ушло 277 попыток. По какой-то причине лишь малая доля гибридов развивались в эмбрионы. После пересадки эмбрионов суррогатным матерям 62 процента плодов были утраченыв десять раз больше, чем при нормальном оплодотворении, а один из клонов умер через несколько минут после рождения. Получается, суммарно успех первого клонирования не дотянул даже до одного процента от попыток.
Из-за невысокой эффективности клонирования на главного создателя знаменитой овечки, шотландского генетика Иэна Уилмута, обрушились скептики: доктор Циндер, микробиолог из Рокфеллеровского университета, и доктор Витторио Сгарамелла из Университета Калабрии в Италии, в письме в Science язвительно указали, что такая крохотная вероятность успеха это «анекдот, а не результат» В значении "единичный случай"/"anecdotal evidence«, а не «шутка, ха-ха».. 30 лет спустя мы можем позволить себе не согласиться с доктором Циндером и доктором Сгарамеллой. С тех пор клонирование переносом ядер успешно прошло не только у Долли, но и у десятка других видов — от мыши до верблюда.
Появление ягненка 6LL3 породило массу исследовательских вопросов. Клоны рождаются здоровыми? Насколько они идентичны клонируемому организму? Как мы можем использовать клонирование в исследованиях, медицине и животноводстве? И наконец, насколько близко мы можем подобраться к клонированию человека?
Одним из главных опасений, которое сопровождало рождение первых клонов, было преждевременное старение. Ведь в момент переноса ядер появляется зародыш с относительно взрослой генетической информацией. В случае овечки Долли в нулевой день на свет появился организм, созданный из клетки шестилетнего животного. Означало ли это, что и Долли родилась шестилетней, земную жизнь пройдя до половины?
Тревожный звонок прозвенел в 1999 году, когда в ДНК Долли обнаружили признаки преждевременного старения: теломеры клонированной из молочной железы овечки оказались короче, чем у овец, клонированных из эмбриональных клетокТеломеры — концевые участки хромосом, которые защищают ДНК от повреждений. Из-за особенностей процесса удвоения ДНК каждое деление клетки теломеры немного укорачиваются, отсчитывая возраст клетки. Чем короче теломеры — тем старше клетка.. Опасения усилились в 2001 году, когда у овечки диагностировали остеоартрит, косвенный признак преждевременного старения. Еще через два года в легких Долли обнаружили опухоль, вызванную инфекцией, и ветеринары приняли решение усыпить животное. На момент смерти ей было всего шесть с половиной лет — едва за 40 по человеческим меркам.
Впрочем, через несколько лет Долли воскресла четыре раза подряд. Из клеток молочной железы, давших начало ягненку 6LL3, получили еще четырех животных — Дейзи, Диану, Дебби и Денис. Вторая партия клонов прожила дольше — сравнимо с продолжительностью обычных овечек. И даже несмотря на преклонные годыНа момент исследования овечкам было больше девяти лет. они не демонстрировали выраженных возрастных нарушений: уровень глюкозы в крови, чувствительность к инсулину и кровяное давление были в норме, а остеоартрит — легким, не требующим лечения. Четыре новых бесконечных овечки немного успокоили исследователей: биологический возраст клона не обязательно побежит впереди хронологического.
Однако проблема ненулевого дня рождения до сих пор окончательного не решена. Возможно, перенос ядра с накопленными мутациями и другими признаками старения все же повышает возраст клона. В пользу этого говорит не только ранняя смерть Долли, но и, например, укороченные теломеры у клонированных коров — а еще то, что некоторых животных не удается клонировать переносом «взрослых» ядер, подходят только зародышевые.
Вероятно, возраст подсаженного ядра — один из факторов, который мешает эффективности клонирования. Но не единственный.
То, что клонирование из зародышевых клеток, как правило, проходит успешнее, чем из соматических, означает, что некоторые условно необратимые изменения в геноме взрослых клеток все же присутствуют — например, это могут быть эпигенетические изменения (метилирование ДНК, деацетилирование гистонов и прочее), которые возникают в момент имплантации эмбриона в матку. Второй набор эпигенетических меток появляется при их дифференцировке, то есть превращении в специализированные клетки с конкретной функцией. В естественных условиях стереть эпигенетические метки удается только во время многоэтапного созревания половых клеток. Но при соматическом переносе ядер геном вынужден перепрограммироваться и стирать эпигенетические метки в аврале, что может привести к ошибкам и гибели эмбрионов.
Стало очевидно: чтобы сделать клонирование более эффективным, придется как-то перемахнуть эпигенетический барьер. Теперь ученые перед пересадкой ядра могут подействовать на соматические клетки веществами, стирающими часть эпигенетических метокНапример, ингибитором метилирования ДНК и ингибитором гистондеацетилазы (HDACi).. После такой обработками выживаемость клонированных эмбрионов кратно растетв некоторых исследованиях — в пять раз. Перепрыгнуть барьер можно с помощью двухэтапного клонирования: сначала обычным переносом ядер от взрослого животного получают ранний зародыш, бластоцист, затем отбирают из него эмбриональные стволовые клетки, а во второе клонирование в яйцеклетку пересаживают ядро от культуры эмбриональных стволовых клеток, чтобы получить полноценное клонированное животное. Двухэтапный протокол успешно используется в случаях, когда обычный одноэтапный перенос ядер не дает результатов, например, при клонировании замороженных животных.
Со временем в клонировании удалось отыскать еще несколько скользких моментов: например, подавление части генов на X-хромосоме и аномалии формирования плаценты. С переменным успехом с этими сложностями удается справляться.
Но бег с препятствиями при клонировании никогда не заканчивается. Наряду с подготовкой соматической клетки, перед слиянием яйцеклетку необходимо довести до определенной стадии созревания, активировать и аккуратно удалить из нее генетический материал. Само слияние клеток должно приходить в определенном растворе и при определенной температуре. Экспериментально сложным является и культивирование эмбрионов, и их перенос в матку. Многие этапы клонирования проводятся в пробирках в инкубаторах — очевидно, что это неидеальная замена естественным условиям оплодотворения и развития эмбрионов. Поэтому даже небольшое отклонение от оптимальных условий на любом из этих этапов может приводить к эпигенетическим изменениям и остановке развития (подробнее про сложности клонирования мы писали в тексте «Как (и зачем) под Москвой корову клонировали»).
Даже если удалось успешно дойти до рождения клона, он может родиться не очень здоровым. У части клонов наблюдаются аномалии развития и хронические заболевания: диабет и лишний вес, дыхательная недостаточность, проблемы с сердцем и почками, аномалии развития конечностей и головного мозга. А процент здорового потомства от исследования к исследованию, от овечки к овечке, — чрезвычайно сильно варьируетсяОдна из часто встречающихся проблем — «синдром крупного потомства», при котором клонированные телята или ягнята рождаются крупнее на 30-40 процентов. Как правило, у таких животных также повышены уровни сахара и глюкозы в крови. Синдром вызван аномалиями развития плаценты. После рождения показатели со временем нормализуются..
Поэтому, несмотря на прогресс в технологии клонирования, даже спустя 30 лет после появления Долли оно остается неэффективным мероприятием по сравнению с обычным размножением: на 100 попыток приходится в лучшем случае 10 качественных эмбрионов. Заметная часть из них все равно погибнет при переносе суррогатной матери. Еще часть умрет сразу после рождения или родится больными. Но даже те клоны, что родятся здоровыми, — окажутся неидеальными копиями.
Клоны, полученные при соматическом переносе ядер, содержат необычный коктейль из митохондрий. Часть митохондрий и, следовательно, митохондриальной ДНК достаются им от донора яйцеклетки, другая — выходит из соматической клетки, которую впрыснули внутрь. Смешение митохондриальной ДНК называется гетероплазмия. И хотя митохондриальная ДНК не в пример меньше ядерной, волей-неволей приходится смириться с тем, что клон оказывается не полностьюВклад митохондриальной ДНК — около 3 процентов. генетически идентичен донору соматической клетки.
Технически обойти эту пренебрежительно маленькую «неидеальность» можно с помощью неортодоксального способа клонирования, который в 2019 году придумал биолог Хуан Карлос Исписуа. В его смелом эксперименте донорную яйцеклетку вообще не использовали: брали соматическую клетку взрослой мыши и воздействовали на нее смесью белков так, чтобы получить «усовершенствованные» плюрипотентные клетки, которые могли дать начало и зародышу, и внезародышевым тканям. Затем на усовершенствованные клетки действовали смесью сигнальных молекул, и вырастало что-то похожее на ранний зародыш — бластоидСтоит ли эта возня трех процентов генетической идентичности, неясно.. Его удалось подселить в матку мыши, но рождения клонированной мышки не последовало. Чуть позже метод опробовали на клетках людей.
Даже если хитрыми манипуляциями добиться полного генетического соответствия, клон все равно, скорее всего, получится не точной копией на уровне фенотипа — то есть на уровне внешних признаков. Когда клонированный эмбрион имплантируют в матку, на его развитие оказывает влияние ход беременности у суррогатной материСкажем, ее инфекции могут повлиять на развитие мозга плода., а после рождения — факторы окружающей среды. Например, качество и количество питания могут сказаться на развитии и весе, а серьезные инфекционные болезни — замедлить рост и повысить риски развития хронических заболеваний. Иногда фенотипические различия у генетически идентичных организмов очень незначительны, а иногда — критичны: например, в 2025 году был описан случай, когда у одного из однояйцевых близнецов обнаружили множественные пороки развития, в то время как другой родился абсолютно здоровым.
Выходит, одинаковый генетический материал — вовсе не гарантия одинаковости. Зачем, в таком случае, исследователи третий десяток лет курочат суставы, колотясь в неподатливое, неэффективное и неидеальное клонирование?
Главной мотивацией создания Долли вовсе не было создание генетически идентичного стада овец. С самого начала клонирование задумывалось лишь как инструмент, который можно было бы объединить с другими репродуктивными технологиями и методами генной инженерии, чтобы получать животных с нужными свойствами быстрее, чем при традиционной селекции. Можно взять клетки обычного животного, отредактировать гены, как нужно, и затем клонировать соматическим переносом ядер, чтобы получить необходимые свойства уже в следующем поколении, а не через десятилетия.
Всего через два года после появления Долли на свет появились три клонированных трансгенных коровы. Телята родились с встроенным в ДНК ферментом бета-галактозидазой. Никакой практической пользы от внесения гена не было, ученые просто продемонстрировали принципиальную возможность сочетания технологий клонирования и редактирования.
С тех пор с помощью комбинации методов появились безрогие коровы и коровы, устойчивые к коровьему бешенству, гуманизированные свиньиорганы которых можно пересаживать человеку и свиньи, устойчивые к вирусу PRRS, мускулистые собаки. В России в 2020 году родился свой трансгенный клон — корова Цветочек, молоко которой не содержит лактоглобулина — основного молочного антигена, который вызывает аллергию. (Подробнее про Цветочек и ее дочь Декабристку можно прочитать в материале «Как (и зачем) под Москвой корову клонировали»).
Несмотря на первоначальные цели, вне исследовательских центров животные из пробирки практически не пасутся. В России клонирование животных не регламентировано строгими запретами, но разводить генетически модифицированный скот запрещено. В Европе клонирование в рамках сельского хозяйства и использование продуктов от клонов тоже запрещено. Американское FDA разрешает пить молоко и есть мясо от клонированных коров, коз и свиней; но к отредактированным клонам относится на порядок строже — поблажки сделаны только для свиней без бетагалактозидазы и двух короткошерстных коров. Сторонники запретительных инициатив в сфере клонирования сельскохозяйственных животных объясняют свою позицию гуманными соображениями: слишком уж велик процент неудач и смертей.
Западные регуляторы допускают клонирование животных в трех случаях: если оно проводится в исследовательских целях, если направлено на сохранение исчезающего вида и если животное — компаньон, вроде любимой собаки. Последней опцией воспользовался аргентинский политик Хавьер Милей, когда клонировал своего мастифа Конана четыре раза. Собаки Мюррей, Милтон, Роберт и Лукас стали одним из центров притяжения его избирательной кампании. Это не единичный случай клонирования питомца: Барбра Стрейзанд дважды клонировала Саманту, собаку породы Котон-де-тулеар, Барри Диллер и Диана фон Фюрстенберг — трижды клонировали джек-рассел-терьера.
Почему воспроизводить сельскохозяйственных животных негуманно, а питомцев — приемлемо, вопрос открытый. По оценкам специалистов для клонирования одной собаки требуется более 100 яйцеклеток, что эквивалентно годовому запасу яйцеклеток от 5-10 доноров. Так что создание копий животных-компаньонов дает простор для этической дискуссии. Тема клонирования человека была лишена этой роскоши практически сразу.
Репродуктивное клонирование человека еще в 1990-х попало под запрет во всем мире. Клонирование подразумевает выращивание эмбрионов, а эмбрионы человека нельзя культивировать дольше двух недель — именно этот срок является водоразделом между бесправным зародышем и неприкосновенной личностью.
Никаких особенных послаблений в жестком правовом регулировании ждать не приходится, по крайней мере до тех пор, пока клонирование по эффективности и безопасности не приблизится к другим репродуктивным технологиям. Никто не решится предпринять попытку копировать человека до тех пор, пока даже клонирование относительно близких нам эволюционно макак заканчивается с ужасающе малым процентом успеха. В 2018 году при использовании зародышевых ядер для соматического переноса из 21 имплантации лишь шесть эмбрионов прижилось и лишь две закончились благополучно; при использовании взрослых клеток — из 42 имплантаций суррогатным матерям 22 эмбриона прижилось, две обезьяны родилось и ни одной не выжило после рождения.
Существует лишь одна лазейка из запретов: рождение — не обязательная часть клонирования человека.
В 2006 году японский исследователь Синъя Яманака создал технологию клеточного репрограммирования. Если на взрослую соматическую клетку подействовать смесью белковвпоследствии названных коктейль Яманаки, она превращается в эмбриональную стволовую, из которой затем можно получить любые ткани организма. Технически клеточная культура, полученная таким способом, — генетический клон организма-источника, поэтому выращивание отдельных частей организма из его репрограммированных клеток сегодня называют терапевтическим клонированием. В отличие от репродуктивного клонирования, ни рождения клона, ни даже имплантации эмбрионов в матку при этом не происходит.
В 2014 году с помощью терапевтического клонирования удалось получить культуру клеток, синтезирующую инсулин. После пересадки мыши такие клетки выделяли этот гормон в ответ на изменение уровня глюкозы в крови. Поэтому в теории терапевтическое клонирование может помочь пациентам с диабетом первого типа, если каким-то образом защитить клонированных подселенцев от аутоимунных атак. С помощью этого способа можно восстановить утраченную популяцию клеток при самых различных заболеваниях: нейроны при болезни Паркинсона и болезни Альцгеймера, поврежденные ткани и органы при раке и других заболеваниях. И хотя терапевтическое клонирование человека в экспериментальных и медицинских целях сейчас разрешено, оно остается строго зарегулированным.
Поэтому самым ценным исходом клонирования за последние десятилетия стали не клоны сами по себе и не их полноценное использование в медицине или сельском хозяйстве, а информация. Долли и все нескончаемые овечки, коровы и мыши, которые появились на свет после нее, расширили понимание эмбрионального развития и клеточной дифференцировки, а также усовершенствовали способы обратить их вспять.