Знакомство с жильцами

Клеток микробиоты в нас с вами в три раза больше, чем клеток из которых, собственно, мы с вами состоим. Микробы живут повсюду: во рту, носу, ушах, кишечнике, легких — и даже глазах. Мы писали о том, кто живет у нас под веками, а теперь решили на этих жильцов посмотреть. У нас были чашки Петри, электрический радиатор, микроскоп, питательная среда для бактерий и несколько образцов микробиома, взятых у главного редактора N + 1 Ильи Ферапонтова. Немного лабораторной магии — и мы выяснили, что в глазе Ильи живут кокки Staphylococcus epidermidis. Рассказываем подробно, как подобный эксперимент можно повторить у себя дома.

Что вам потребуется

1. Чашки Петри, 5-10 штук 
2. Агар 
3. Лизогенная питательная среда LB 
4. Глюкоза 
5. Микробиологические петли 
6. Перчатки и маска
7. Кухонные весы или хотя бы «весовое» приложение на смартфоне
8. Кухонная плита

Достать предметы из пунктов 1-5 можно, просто купив

для школьных лабораторных работ: он обойдется вам примерно в 5 тысяч рублей.

Готовим питательную среду

1. Возьмите любую емкость, объем которой вам известен, и налейте туда воды.
2. Засыпьте в чашку LB из расчета 25 грамм на литр.
3. Отправьте туда же агар из того расчета, чтобы его доля в растворе была около 1-2%.
4. Вскипятите всю смесь (сделайте это в микроволновке, например), чтобы агар растворился, а затем дайте ей остыть.
5. Добавьте в раствор глюкозы из расчета 360 миллиграмм на 100 миллилитр. Можно больше — но в пределах разумного. Можете добавить дрожжевой экстракт: в нем есть факторы роста, нужные некоторым бактериям.
6. Нагрейте все это до 80 градусов (тут вам пригодится градусник для духовки или просто цифровой термометр с щупом). Все, среда готова.

Переносим среду в чашку

Перед тем, как наносить среду на поверхность чашки, необходимо ее простерилизовать — чтобы не вырастить в чашке ничего лишнего.

Существует множество методов стерилизации, но в домашних условиях самое удачное решение — это нагревание. Подойдет открытое пламя газовой горелки или конфорки — надо будет только снять с ее верха крышку. Вертикальные языки пламени в ладонь высотой создают вокруг себя цикличное завихрение горячего воздуха, и тот обеспечивает вам «антибактериальную зону» диаметром примерно двадцать сантиметров.

1. Возьмите чашку Петри и нагрейте ее до 80 градусов — или просто окуните ее в кипяток (осторожно, не ошпарьтесь!). Подождите пятнадцать минут, чтобы она остыла, нагрейте еще раз. Повторите эту процедуру как минимум пять раз (можно больше). Поздравляем! Теперь у вас есть стерильная поверхность, на которую можно нанести питательную среду.
2. Поставьте ваши чашки Петри рядом с горелкой/конфоркой, включите огонь и подождите 5-10 минут.  
3. Залейте чашку Петри еще горячей средой, закройте их и дождитесь, пока среда не застынет. Оставьте в чашке немного пространства, не заполняйте чашку до краев! Застывшая среда по консистенции должна напоминать твердое желе.

Берем пробу

Мы выращивали микробиом глаза, поэтому использовали инокуляционную петлю для мазка — если вам к себе (или кому-то еще) под веки лезть не очень хочется, можете просто опустить в чашку Петри палец, тогда вы занесете туда всех микробов, что на нем живут. 

1. Возьмите стерильную инокуляционную петлю. Пластиковые продаются уже простерилизованными. Если у вас петля металлическая, то сначала прокалите ее докрасна в пламени, остудите касанием среды и сразу берите мазок. Мы брали мазок из глаза, носа и рта главного редактора N + 1 пластиковой петлей. Мы были осторожны, он не пострадал.
2. После мазка нанесите длинный штрих петлей на поверхность чашки Петри без нажатия.
3. Теперь закройте чашку и переверните средой вверх. Чашка всегда должна находиться перевернутой — то есть твердой средой вверх, чтобы капли конденсата не падали на ее поверхность. Для уменьшения высыхания можно также попробовать герметизировать края чашки, но так, чтобы минимальный обмен воздуха сохранился.

Важно: От открытия до закрытия чашки все действия следует производить строго в «антибактериальной зоне» горелки, чтобы в чашку не осели ненужные нам бактерии.

Теперь осталось только дождаться, пока бактерии размножатся. В чашке надо воспроизвести температуру, близкую к температуре тела. Чем теплее, тем быстрее будет рост. Тут вам пригодится батарея. 

Чтобы выросли крупные колонии, нужно примерно от двух до четырех дней, но уже на первые сутки вы, скорее всего, уже сможете разглядеть небольшие слизистые комочки на поверхности чашки.

Кто вырос?

Ради чистоты эксперимента мы брали несколько мазков: один с середины глаза, другой с самого его края, предполагая, что так шанс захватить больше разных видов, которых и так мало в глазном микробиоме.

Поначалу мы не могли добиться роста ни одной из бактерий, растущих в глазу. 

Но путем подбора условий — добавили дрожжи в оригинальную среду, увеличили количество глюкозы, сделали среду более жидкой — нам это удалось. 

Если все прошло удачно (нам для первых глазных колоний понадобилось два захода), то у вас есть выросшие бактерии. Хотите взглянуть поближе? Доставайте микроскоп. 

Для того, чтобы рассмотреть бактерии, достаточно 600-кратного увеличения, но для адекватной картинки все же лучше иметь 900-кратный микроскоп. Многие «школьные» микроскопы с таким справятся.

Теперь давайте открывать чашку Петри с нашими колониями.

Важно: Все бактерии, которые мы выращиваем, условно-патогенные, так лучше всего быть осторожным. Чтобы соблюсти меры безопасности, надо надеть маску и перчатки.

Откройте чашку. Вы наверняка почувствуете неприятный запах — это продукты жизнедеятельности бактерий. Для того, чтобы увидеть наших друзей, достаточно простого препарата «раздавленная капля» — возьмите мазок со среды, разбавьте его каплей воды, а далее нанесите на предметное стекло.

Лучший способ узнать, что же выросло в вашей чашке, не прибегая к помощи секвенирования, — это сопоставить ваши результаты и научные данные. Воспользуйтесь базами научных исследований и статей, например PubMed.

Чтобы убедиться в том, что мы вырастили именно глазных микробов, мы обратились к свежим данным метагеномики микробиома глаза. В него входит всего десять систематических групп, при этом они достаточно разные. Это дало нам возможность соотнести то, что мы смогли вырастить, с уже известной глазной фауной.

Сначала мы сравнили морфологию наших бактерий со всеми видами бактерий, перечисленных в уже упомянутой статье — и выяснили, что морфологически она очень похожа на колонии S. epidermidis. 

Во-вторых, распределение колоний на чашке было очень похоже на данные метагеномики. На фотографии ниже видно, что бактерий из пробы с края глаза — которая была нужна, чтобы определить число бактерий в глазной слизи — меньше, чем бактерий в пробе из конъюктивного мешка. Это же подтверждают и данные метагеномного исследования.