Шанс на индульгенцию

Биохимики во всем мире разрабатывают все более точные, быстрые, дешевые и простые тест-системы для определения нового коронавируса: чем быстрее поставишь диагноз, тем больше жизней спасешь. Но прямо сейчас создаются и тесты, которые опознают заражение уже после того, как у пациента появились клинические признаки болезни, или он уже выздоровел. Зачем нужны такие тесты и как их делают, N+1 рассказал Александр Иванов, сотрудник Института молекулярной биологии имени Энгельгардта, где был разработан такой тест.

Дело Краммера

Этот проект начался благодаря американскому вирусологу Флориану Краммеру из Маунт-Синай в Нью-Йорке. Он и его группа занимается респираторными вирусами, но в основном — вирусом гриппа. С середины декабря — начала января, когда стало понятно, что в Китае началась эпидемия, Флориан Краммер и его коллеги сказали: «Мы должны сделать тест-систему».

Когда инфекция попала в США, тестирование на себя взяла CDC, организация по контролю за инфекционными заболеваниями (российский аналог — Роспотребнадзор). А остальным запретила. А тестирование у нее шло крайне медленно. В какой-то момент свою тест-систему по ПЦР сделали в университете штата Вашингтон, начали массовое тестирование, и именно в этом регионе тогда начался резкий рост количества заболевших — просто потому, что там стали тестировать, не дожидаясь CDC.

Краммер был одним из тех, кто говорил, что на самом деле распространение инфекции намного больше, что число зараженных в десятки раз выше, чем в медицинской статистике. Он, например, указывал, что в Канаде стали обнаруживать заболевших, приехавших из тех американских штатов, где CDC случаев болезни не заметило.

Здесь надо сказать, что есть ПЦР-тесты — они нужны для того, чтобы определить, болен человек коронавирусной инфекцией или нет — а есть тесты на антитела к вирусу. Эти тесты нужны для немного разных задач. Первый позволяет определить больных и изолировать (чтобы они заразили как можно меньше здоровых). А второй позволяет идентифицировать нам коронавирусную инфекцию либо уже на довольно позднем периоде — либо определить, что этот человек уже приобрел иммунитет к ней. И значит ему уже не надо сидеть на карантине, он может контактировать с больными и так далее — это важно, например, для врачей. ПЦР тест-система такого не может. 

Поэтому нужен простой, дешевый и точный тест на антитела, то есть на белки, которые иммунная система производит в ответ на вторжение вируса. По некоторым оценкам, антитела можно обнаружить по меньшей мере через год после болезни, а то и десяти лет. И тест на антитела — единственный надежный способ выяснить, переболел ли человек соответствующей инфекцией и сформировал ли против нее иммунитет.

Плазмида в конверте

Самого вируса в лаборатории Краммера не было, как и у большинства микробиологов мира. Зато он был в распоряжении ученых из Уханя, Сингапура, многих других — и уже в январе первые геномы возбудителя COVID-19 были расшифрованы и выложены в открытый доступ.

Американцы взяли тот фрагмент вирусного генома, который кодирует вирусный S-белок, spike, «шип». Вирус использует его, чтобы приклеиться к клетке (а затем проникнуть внутрь), и по нему же вирус опознает иммунная система.

Ген S–белка достаточно большой, почти 4 тысячи нуклеотидов. Специальные приборы-синтезаторы позволяют получать только короткие фрагменты длиной около 100 нуклеотидов. Склеить 40 таких кусочков — уже нетривиальная задача, даже в режиме аврала на это нужно месяц-полтора работы.

Для этого вам нужно взять синтезированные кусочки, налить фермент, который их склеивает, вставить в вектор и прогнать это все через бактерию, которая их размножает, проверить, и повторить этот цикл множество раз — как на кухне. Требуется много терпения, внимания.

В конечном счете они получили плазмиду — кольцевой фрагмент ДНК с геном S-белка. С помощью этой плазмиды они наладили поточное производство вирусного S-белка в клетках бактерий. А полученный белок уже использовали для тест-системы: проверять, у кого в организме найдутся антитела, способные с ним связаться.

Но Краммер не просто сделал эту плазмиду. Одна из заслуг его команды в том, что они оптимизировали ген S-белка, чтобы его было легче нарабатывать в клеточной культуре. Например, они искусственно подправили ген так, чтобы белок не оставался в клетке, а сразу экспортировался из клетки в среду. Кроме того, они пришили к нему специальную метку, которая позволяет отслеживать белок (и связанные с ним антитела) на хроматограмме. Еще одна модификация потребовалась, чтобы заставить полученные молекулы белка соединяться по трое — в тримеры, чтобы тест был эффективнее. Наконец, они добавили к гену маркер устойчивости к бактериальному антибиотику, чтобы плазмиды было удобнее нарабатывать в определенных бактериях. В общем, огромная дизайнерская работа.

А потом они встали и сказали: мы сделали такие плазмиды, при помощи них можно нарабатывать белки. Их можно класть в основу вот этой системы анализа, можно ловить антитела. Они у нас есть, мы готовы предоставить их всем. И разослали их по десяткам лабораторий по всему миру абсолютно бесплатно, потому что считают, что тестирование должно быть массовым и доступным.

Пуск клеточного завода

Через неделю после того, как я написал Краммеру, мы получили плазмиду. Грубо говоря, это инструкция по производству вирусного белка. Это еще не тест-система, до нее еще далеко. Теперь эту плазмиду нужно встроить в машину, которая его производит.

Сначала нам нужно было добиться, чтобы плазмиды попали внутрь бактерий.

Обычно для этого используют кишечную палочку. Если ее выдерживать в растворе хлорида кальция и некоторых других ионов в определенной концентрации, то если затем температура среды начинает колебаться, она начинает вбирать в себя ДНК.

Так плазмида попадает внутрь бактерий и начинает реплицироваться, используя внутреннюю машинерию бактерий. Внутри одной бактерии может наработаться таким образом около тысячи плазмид. Затем эти «банки с плазмидами» вскрывают с помощью набора реагентов, фильтруют и где-то за час-два вы получаете чистый раствор с плазмидами.

«Наварив» таким образом плазмиды, полученные от Краммера, мы занялись производством самого вирусного белка.

Обычно для получения белка используют те же кишечные палочки: они очень хорошо нарабатывают белки в больших количествах — десятки, сотни миллиграммов. Но мы взяли клетки млекопитающих, потому что многие белки в эукариотических клетках модифицируются: на белок навешиваются остатки фосфорной кислоты, сахара. И если ты делаешь тест-систему, то ее специфичность, способность «узнавать» антитела может зависеть не только от белка, но и от таких посттрансляционных модификаций. Бактерии такие посттрансляционные модификации белков делать не умеют, поэтому нужны клетки млекопитающих. Для нас, для моей лаборатории это был первый подобный опыт.

Мы брали два вида клеток — это линия клеток хомячка, которые часто используют в этой роли фабрики, и линия человеческих клеток HEK, это эмбриональные клетки почки. Эта линия тоже есть почти в каждой лаборатории.

С помощью еще одного реагента мы упаковали плазмидную ДНК в липосомы — липидные капсулы. В них молекулы ДНК, как в мыльной оболочке, проскальзывают сквозь мембрану в клетки. И дальше эта клетка преврашается в фабрику вирусного S-белка. Благодаря дизайну Краммера этот белок не накапливается внутри клеток, а сразу экспортируется в культурную среду, то есть наружу клеток, и нам остается только его собрать.

За четыре дня количество клеток, эквивалентное примерно шести чашкам Петри (мы не использовали сами чашки, мы размножали клетки в специальных роллерных бутылях) наработало примерно 0,1 миллиграмма вирусного белка.

Встречаем антитела

Затем практически невидимое количество белка — 2 микрограмма — было распределено по 96 ячейкам экспериментального планшета. Осталось лишь проверить, сможет ли этот белок узнать антитела к вирусу.

Для этого нам нужна была кровь людей, которые переболели коронавирусной инфекцией, то есть тех, кто раньше получил положительный результат ПЦР-теста на коронавирус, но теперь полностью выздоровел — то есть тот же ПЦР-тест показал уже отрицательный результат.

Найти переболевших нам помогла группа из «Гемцентра» во главе с Григорием Ефимовым, поскольку у них, как у медицинской организации, было право работать с переболевшими.

Капли плазмы крови людей, перенесших COVID-19, и контрольные пробы накапали в ячейки этого планшета. Механизм тут простой: если в крови есть антитела, они должны связаться с вирусным белком. Правда увидеть это не так просто, для этого требуется еще несколько стадий обработки.

Вот ваш вирусный белок на дне ячейки связался с антителами к этому белку из плазмы крови. Дальше ячейку отмывают от плазмы, и помещают туда антитела животных — кроликов или мышей — к иммуноглобулинам человека, то есть к человеческим антителам. К этим вторым антителам присоединен маячок — флуоресцентная метка или фермент для цветной реакции.

Антитела животных присоединяются к человеческим и получается такой тройной бутерброд – вирусный белок, человеческие антитела и эти вторичные меченые антитела. Дальше вам остается только покрасить, сделать видимыми белки, где присутствуют антитела.

В эксперименте участвовали трое человек, перенесших коронавирусную инфекцию, и десятеро не болевших людей. У теста не было зафиксировано ни ложноположительных, ни ложноотрицательных срабатываний.

Плазма разводилась примерно в 20-50 раз, но чувствительность метода позволяет разводить ее и в 600-800 раз. При этом в самой ячейке достаточно 20 нанограммов вирусного белка.

Для того, чтобы этот тест идти и дальше использовать, нам еще нужно еще несколько раз проверить и получить правильный результат при тестировании пациентов, переболевших коронавирусной инфекцией. Есть и технические моменты. Например, нужно определить, в каких количествах нужно сыворотку добавлять, как сыворотку разводить — где у нее предел концентрации?

Во-вторых нам еще нужно будет брать сыворотки от пациентов с другими коронавирусными инфекциями, не COVID-19, чтобы сказать, имеют ли они кросс-реактивность — вдруг мы ловим вообще все коронавирусы? Потому что это тоже важный момент. И третья вещь – это ложноположительные сигналы. Для этого нам тоже нужно протестировать еще сотни две-три, а то и больше больных, сравнивать их с теми, кто явно не болел, а ещё лучше – проверить это на образцах, взятых, например, до прошлой осени. В которых заведомо не было вируса. И смотреть, не сыграет ли кто-то из них, не даст ли положительный сигнал.