Иголка в стоге данных

В 1950–1960-х годах от бессонницы и тошноты при беременности часто назначали талидомид, препарат, который, как тогда было принято, успешно прошел все испытания на крысах и мышах. Однако крысы и мыши — все же не люди, и у них талидомид не вызывает очень тяжелые врожденные дефекты конечностей, с которыми в итоге родилось около 10 тысяч детей. Многие «дети талидомида» живы до сих пор, и ученые продолжают изучать его токсическое действие. Возможно ли повторение такой истории сегодня? Скорее всего, нет, потому что наряду с появлением более продвинутых инструментов для токсикологических исследований изменился и сам подход к ним. N + 1 рассказывает, что такое системная токсикология и зачем она нужна.

В научном консорциуме Human Toxicology Project подсчитали, что одно полное исследование токсичности одного пестицида на животных обходится в 3 миллиона долларов и может занимать до 10 лет. Именно такое исследование необходимо, чтобы выпустить пестицид на рынок или запретить его. Для этого понадобятся несколько экспериментов на животных — на острую реакцию, когда определяется доза, опасная для организма при однократном воздействии; на хроническое влияние, когда мышь или кролик терпят небольшие дозы в течение месяца, трех или года; и на репродуктивную токсичность, или тератогенные свойства препарата (как он влияет на потомство).

Human Toxicology Project — международное объединение, куда входят такие разные организации, как, например, Dow Chemical, L’Oreal, Unilever и борцы за права животных Humane Society. Своей задачей консорциум видит продвижение нового подхода к токсикологическим исследованиям. Новый — значит более экономичный во всех смыслах и при этом дающий настолько же или даже более надежный результат, что и «традиционные» токсикологические исследования.

Компания«Филип Моррис Интернэшнл» (ФМИ) с помощью методов системной токсикологии оценивает потенциал своих инновационных продуктов с пониженным риском, например, системы нагревания табака IQOS.

«[Традиционный] подход к тестированию на токсичность — как к списку с галочками: все галочки поставил и вперед. Но при этом вы ничего не узнаёте о том, что делает это соединение на молекулярном уровне, и не получаете никакой информации, которая могла бы помочь в прогнозировании результатов и улучшении показателей. Мы уже 50 с лишним лет занимаемся такой токсикологией, а исследования на животных до сих пор часто дают сомнительные результаты — и мы не знаем, почему», — говорит Кэтрин Уиллет, директор по науке и регулированию в научно-токсикологическом подразделении Humane Society International.

Если забраться в недра сайта консорциума, то можно найти красивую инфографику, которая сравнивает этот традиционный подход с ToxCast. Это аналитическая программа американского Агентства по защите окружающей среды (EPA), которая сочетает старые добрые токсикологические методы — тесты in vitro, то есть в пробирках и чашках Петри, на клетках, белках и других биологических молекулах, и модели для прогнозирования токсичности, построенные вычислительными методами. В базе данных программы уже есть информация о 1,8 тысячи компонентов промышленных и потребительских продуктов, пищевых добавок и так далее. В год она способна обрабатывать до 4 тысяч соединений, а стоимость одного полного тестирования через 10 лет, по оценкам консорциума, снизится в десять раз до 6 тысяч долларов.

На основе одной ToxCast пока нельзя принимать решения о запрете или разрешении чего бы то ни было. Но, надежно отфильтровывая однозначно токсичные соединения-кандидаты, программа уже помогает сэкономить время и существенно уменьшить количество животных в экспериментах. ToxCast — часть другого крупного американского токсикологического проекта, Tox21, призванного, как и консорциум, «переизобрести» токсикологию. Tox21 — это сокращение от Toxicology in the 21st Century, «токсикология XXI века», и, судя по всему, эта токсикология нынешнего столетия будет системной.

Есть ли в системе системность?

Системная токсикология отличается от «бессистемной», то есть обычной, тем, что использует подходы биоинформатики и вычислительной биологии для решения классических токсикологических задач. Строго говоря, токсикология всегда пыталась ответить на вопрос, как тот или иной ксенобиотик влияет на организм как биологическую систему, но эта система настолько сложна, что исследование ее обычными методами часто напоминает исследование слепыми слона из известной древнеиндийской притчи.

«Традиционные токсикологические исследования в основном устроены так: вы отравляете животных передозировкой чего-либо и смотрите, что произошло. Затем вы их убиваете, берете образцы крови и тканей, смотрите на органы», — говорит Уиллет. По ее словам, в таком исследовании собирается очень мало информации на молекулярном уровне, например, о том, как взаимодействуют между собой отдельные клетки.

Системная токсикология начинает разговор о токсичности того или иного соединения с самого начала — с того, какие молекулярные механизмы приводят к наблюдаемой в эксперименте реакции. Поднимаясь все выше и выше, можно дойти до понимания свойств системы, которые нельзя предсказать по отдельным ее компонентам: возможно, главное такое свойство — это сама многоклеточная жизнь, существование которой нельзя вывести, исследуя только один эритроцит или нейрон.

В обзоре работ по системной токсикологии Ник Плант из университета Лидса пишет, что первые публикации на эту тему появились в 2003 году. Спустя 15 лет эти методы используют как ученые, так и, например, фармацевтические компании, которым они помогают безболезненно (то есть быстро и без затратных и долгих исследований на животных) отбраковывать бесперспективные из-за токсичности соединения. Помимо потенциальных лекарств, системная токсикология имеет дело и с так называемой «зеленой химией»: это направление исследований ищет безопасные альтернативы токсичным химикатам, используемым в технологических процессах, сельском хозяйстве и других областях.

На примере лекарств можно понять, чем отличается системный подход в токсикологии. Плант отмечает, что в рамках традиционного взгляда на работу лекарства считается, что оно точечно взаимодействует с конкретным целевым белком, а побочные взаимодействия с другими белками считаются причиной нежелательной токсичности. «Однако в реальности каждое соединение почти наверняка будет взаимодействовать с несколькими белками, а те, в свою очередь, тоже будут взаимодействовать с другими белками, и так далее. И желательное фармакологическое действие, и нежелательная токсичность — это следствия такой сложной сети... Чтобы извлечь максимальную пользу из этой сетевой парадигмы, очевидно, надо понимать, как работает сеть», — пишет ученый.

Современные методы геномики, транскриптомики, протеомики и других «омик» (все вместе это обычно называют омиксными технологиями) позволяют нам собрать невероятное количество новых данных о работе этой сети в дополнение к тому, что мы уже знаем о работе биологических систем. Чтобы не потеряться в этих данных и найти по-настоящему важную информацию, и нужен системный подход.

«Системная токсикология помогает найти иголку в стоге сена», — говорит Ян Хенгстлер, руководитель департамента токсикологии и системной токсикологии в Лейбницевском научном центре окружающей среды и человеческих факторов при университете Дортмунда. По его словам, сегодня анализ экспрессии всех генов или всех белков в клетке — обычное дело, поскольку нужные инструменты дешевы и работают быстро. «С помощью специальных программ вы можете выяснить, как тысяча активированных генов влияла друг на друга: обычно соединение влияет на фактор транскрипции какого-либо гена, и это запускает лавину эффектов», — говорит Хенгстлер.

Жутко быстро и запредельно ясно

Зная механизм какого-либо воздействия, можно точно прогнозировать его результат даже спустя годы, при этом сделать это можно гораздо быстрее. Мануэль Пайтч, главное должностное лицо по научным вопросам ФМИ, рассказывает о серии экспериментов по изучению канцерогенности формальдегида, где авторы сначала провели стандартное двухлетнее исследование на крысах, считая количество опухолей у животных, получивших разные дозы канцерогена. «Спустя несколько лет они провели еще одно исследование, уже за 13 недель — за такое время опухоли не появляются, но можно собрать системные данные геномики, транскриптомики и так далее. Посмотрев на эти данные механистическим взглядом системной токсикологии, можно понять, какие дозы вызовут рак, а какие нет», — говорит Пайтч.

Дополнительный плюс таких исследований в том, что крыс и мышей надо каждый раз покупать или разводить заново, а вот к полученным данным можно возвращаться неоднократно, задавая вопросы, которые никому не пришли в голову на этапе разработки методики эксперимента. Более того, если сохранять не только данные, но и РНК, белки и даже целые органы, к их исследованию тоже можно будет вернуться с новыми инструментами и математическими методами. В ФМИ делают это постоянно: по словам представителей компании, работа продолжается в том числе и с образцами, полученными в 2011 году, — ни одна лабораторная мышь столько не проживет.

Эксперимент в системной токсикологии начинается так же, как в обычной: нужно определить, какой именно показатель вы изучаете и в чем состоит экспозом (exposome) — так, по аналогии с геномом и прочими «омами», предложили называть всю совокупность факторов внешней среды, воздействующих на исследуемый объект. «Вся биология „ниже по течению“ однозначно зависит от того, как происходит контакт с изучаемым соединением, насколько качественно проводится экспозиция. Поэтому мы тратим на это очень много усилий: например, во время экспериментов на животных мы постоянно проверяем состав атмосферы, иногда трижды в день, чтобы следить за стабильностью ее состава», — объясняет Пайтч.

Дальше выбирают измеряемые показатели, и здесь все начинается с классических токсикологических параметров вроде цитотоксичности — свойства препаратов вызывать патологические изменения в клетках. Но системные токсикологи обычно собирают данные и об экспрессии генов, генетических мутациях, эпигенетических изменениях, синтезе белков, метаболитах и так далее. Все это вместе определяет количество животных или клеточных культур, которые понадобятся, чтобы обеспечить исследованию достаточную статистическую мощность — вероятность того, что вы отклоните нулевую гипотезу вашего исследования в случае, когда она действительно не верна (то есть действительно обнаружите какой-то эффект). Дальше — дело логистики.

In silico we trust

Логистика любых «мокрых» биологических экспериментов, в которых участвуют живые клетки или целые организмы, мягко говоря, непроста: для этого необходимы специально оснащенная лаборатория и инструменты, а животных надо кормить и развлекать (к примеру, лабораторным мышам потребуется материал для гнезд) — и даже в этом случае можно навлечь на себя гнев зоозащитников. Словом, в «сухой» лаборатории, где основной прибор — компьютер, жить было бы проще.

«В области компьютерных методов in silico (по аналогии с in vitro и in vivo — N + 1) много, скажем так, мифологии. Пока не существует по-настоящему хороших прогностических моделей. Методы in silico хорошо подходят для обучения на массивах данных и построения аналогий. Они могут дать вам 80 процентов верного ответа, но сложности, как всегда, в деталях», — говорит Мануэль Пайтч.

Компьютер по определению не может знать то, чему его не учили. Кроме того, любой человек, который имел дело с какой бы то ни было моделью, хорошо знает принцип garbage in, garbage out, «мусор на входе — мусор на выходе»: качество и точность прогнозов модели очень сильно зависит от качества исходных данных. Если они у вас плохие, выводы тоже получатся так себе.

Уиллет подчеркивает, что сейчас прогностические модели создаются только для отдельных химических соединений и видов токсичности и для многих из них таких моделей пока просто нет. Кроме того, описание биологических механизмов токсичности еще «мозаичное», считает эксперт: чтобы получить модель, способную на полноценные прогнозы, надо описать все наиболее важные механизмы и объединить их в сеть — для этого понадобится совместная работа всего научного сообщества.

«Я действительно считаю, что, когда мы это сделаем, для адекватной защиты здоровья людей эксперименты на животных больше не понадобятся. Я пока не уверена, что мы сможем делать достаточно точные предсказания только лишь на основе химической структуры, без тестов in vitro, но возможно и такое», — говорит Уиллет.

При этом без математических методов и моделей, нейронных сетей и прочих инструментов исследований in silico невозможно анализировать те самые массивы данных, которые необходимы системной токсикологии. Кроме того, еще одно направление ее работы — описание биологических систем с помощью динамических уравнений. Здесь, помимо детального понимания всех моделируемых механизмов, нужно очень большое количество данных, которых пока недостаточно.

«Я не утверждаю, что [методы in silico] никогда не заменят in vitro и in vivo, но, скорее всего, это не произойдет при моей жизни», — резюмирует Пайтч. Хенгстлер согласен: «Теоретически «виртуальный человек» или «виртуальная мышь» возможны. Однако прежде чем моделировать их, нужно знать все компоненты организма и их взаимодействия. Это, скорее, задача для нескольких поколений ученых, а не проект на 10-20 лет».

Но есть и хорошие для мышей и экоактивистов новости: во всем научном мире сейчас активно разрабатываются «органы-на-чипе», имитирующие реальные органы и их части (например, клетки кровеносных сосудов, женскую репродуктивную систему и сердечную мышцу). Системная токсикология здесь помогает понять, что именно можно и нельзя будет воспроизвести, — и все же отказаться от животных в пользу целого «человека-на-чипе».

«Это моя мечта, потому что это кажется простой задачей на первый взгляд, и вокруг этого много общественного активизма. Некоторые люди утверждают, что тесты на животных неэффективны и тому подобное, но пока мы все еще не можем воссоздать в чашке Петри эмфизему, хронический бронхит или атеросклеротическую бляшку», — говорит Пайтч.

Перевод с мышиного на человеческий

Humane Society пишет, что в ходе полного исследования одного пестицида — том самом, которое обходится в 3 миллиона долларов, — гибнут до 10 тысяч лабораторных животных. Чтобы их смерть не была бессмысленной, важно, чтобы результаты, полученные в таких экспериментах, можно было транслировать на людей, то есть чтобы выводы, сделанные на крысах, кроликах и рыбках, оказывались верными и для нас с вами.

С этим есть проблема. Например, в 1990-х годах в Бостонском детском госпитале разработали эндостатин — соединение, излечивавшее несколько видов рака у мышей без каких-либо побочных эффектов. Журналисты назвали эндостатин чудо-лекарством от рака, однако в испытаниях на людях он показал очень слабые результаты. Авторы одного обзора 2006 года изучили 76 высокоцитируемых исследований на лабораторных животных, опубликованных в журналах уровня Nature и Cell — то есть довольно высокого уровня, — и обнаружили, что только для 37 процентов из них эффект удалось воспроизвести на людях, а в 18 процентах результаты на людях и вовсе противоречили выводам исходной работы.

Частично это объясняется проблемой воспроизводимости исследований в принципе: даже публикация в очень хорошем журнале, к сожалению, не гарантирует, что если вы проведете этот же эксперимент еще раз, вы получите такой же результат. Возможно, у авторов исследования было слишком мало подопытных животных, несовершенные инструменты или ошибки в статистике — или же они просто решили сжульничать. Но иногда все сделано правильно — а лекарство все равно не работает.

О плохой статистике американское Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) говорило еще в 2004 году: тогда для нового препарата, достигшего первой фазы клинических испытаний на людях, вероятность попасть на рынок в итоге составляла лишь 8 процентов. То есть девять из десяти лекарств, вроде бы успешно испытанных на клеточных культурах и животных, в испытаниях на людях оказывались либо токсичными, либо бесполезными.

Системная токсикология благодаря глубокому пониманию биологических механизмов помогает предположить, какие процессы и явления можно будет «перевести» с крыс, мышей или других животных на человека. Так, в ходе изучения воздействия сигаретного дыма на организм ученые узнали, что воспаление и повреждение ДНК у мышей происходит так же, как у людей, а вот некоторые клетки крови ведут себя иначе.

«В последние годы было несколько громких провалов лекарств, которые показались перспективными в исследованиях на животных – так случилось, например, с препаратами для лечения болезни Альцгеймера и с новым антибиотиком против туберкулеза. Разве животные в этом виноваты? Нет, виноваты люди, которые недостаточно тщательно подошли к исследованиям, не учли разницу между биологией животных и человека, и не использовали системный подход для того, чтобы действительно понять, что может и чего не может предсказать модель», — говорит Пайтч.

Кэтрин Уиллет считает, что системная токсикология — на самом деле единственный способ изменить печальную статистику с переходом от лабораторных животных к людям. «Наша способность производить лучшие лекарства будет сильно зависеть от системного понимания биологии человека и процесса разработки лекарств — только когда мы достигнем этого понимания, мы сможем создавать эффективную терапию», — говорит эксперт. «По-моему, ситуация меняется, и люди используют системный подход все чаще и чаще», — согласен Пайтч.