«Ген. Очень личная история»

Мы наследуем от своих родителей все: от цвета волос и глаз до болезней. Хотя о механизме наследования науке известно относительно недавно, сегодня мы умеем изучать и менять гены не только в пробирке, но и в человеческих клетках. Это позволяет узнавать о пагубных мутациях у ребенка еще до рождения и дает надежду на победу над наследственными заболеваниями в будущем. В книге «Ген. Очень личная история» (издательство «Corpus»), переведенной на русский язык Ольгой Волковой и Ксенией Сайфулиной, врач и ученый Сиддхартха Мукерджи рассказывает о зарождении и развитии науки о наследственности и концепции гена, а также о том, как его семья столкнулась с психическим заболеванием, передающемся из поколения в поколение. Предлагаем вам ознакомиться с фрагментом, посвященным экспериментам биохимика Пола Берга по созданию рекомбинантной ДНК, то есть объединению генов разных организмов.

Кроссинговер

Что за мастерское создание — человек! Как благороден разумом! Как беспределен в своих способностях, обличьях и движениях! Как точен и чудесен в действии! Как он похож на ангела глубоким постижением! Как он похож на некоего бога!

Уильям Шекспир.
Гамлет, акт II, сцена 2 

Зимой 1968-го Пол Берг вернулся в Стэнфорд после 11-месячного академического отпуска, проведенного в Ла-Хойе, в Институте Солка. Бергу исполнился 41 год. У него было атлетическое телосложение и привычка слегка горбиться при ходьбе. Детство в Бруклине наложило едва уловимый отпечаток на манеры Берга — это ощущалось, скажем, в том, как в пылу научного спора он вскидывал руку и начинал предложение со слова «смотри». Его восхищали люди искусства, особенно художники и особенно абстрактные экспрессионисты: Поллок и Дибенкорн, Ньюман и Франкенталер. Берга очаровывала отлично удавшаяся им трансмутация старого языка в новый: то, как художники сумели приспособить ключевые инструменты абстракционизма — свет, линии, формы — к сотворению гигантских холстов, пульсирующих необыкновенной жизнью.  

После защиты диссертации Берг занимался биохимией в Университете Вашингтона в Сент-Луисе вместе с Артуром Корнбергом, и с ним же потом основал кафедру биохимии в Стэнфорде. Большую часть своей академической жизни Берг изучал синтез белков, но поездка в Ла-Хойю дала ему возможность обдумать и другие темы. Забравшийся на высокое плато над Тихим океаном, Институт Солка по утрам часто прятался за плотной стеной тумана, напоминая монашескую обитель. Присоединившись к группе вирусолога Ренато Дульбекко, Берг сфокусировался на из учении вирусов животных. Все 11 месяцев он размышлял о генах, вирусах и передаче наследственной информации.  

Особенно заинтересовал Берга обезьяний вирус 40, или SV40, поражающий клетки обезьян и человека. Каждый вирус, образно выражаясь, профессиональный носитель генов. У этих существ очень простая структура: часто это не более чем генный комплект в оболочке — «плохие новости в белковой упаковке», по выражению иммунолога Питера Медавара. Внедряясь в клетку, вирус теряет оболочку и начинает использовать клетку как фабрику для копирования своих генов и производства новых оболочек, в результате чего наружу выходят миллионы новых вирусов. Это жизненный цикл, дистиллированный до самого необходимого, до чистого смысла. Вирусы существуют для того, чтобы заражать и размножаться, а заражают и размножаются для того, чтобы существовать.  

Но даже в таком незамысловатом мире кристаллизованных сущностей жизненный цикл SV40 казался экстремально упрощенным. Его геном — ничтожный клочок ДНК: он в 600 тысяч раз короче генома человека и содержит всего семь генов (для сравнения: у человека их примерно 21 тысяча). В отличие от большинства вирусов, как узнал Берг, SV40 может достаточно мирно сосуществовать с некоторыми типами зараженных клеток. Вместо того чтобы сразу запускать производство миллионов новых вирионов и губить тем самым клетку. SV40 может внедрять свою ДНК в хромосому хозяина и впадать в репродуктивную дрему, ожидая особых активирующих сигналов.  

Эффективность проникновения в клетку и компактность генома SV40 делали его идеальным транспортом для доставки генов в клетки человека. Берга поглотила эта идея: если суметь экипировать SV40 «чужим» геном (чужим для вируса, по крайней мере), вирус контрабандой протащит его в клетку человека и, соответственно, изменит ее наследственную информацию. Такой трюк определенно откроет новые горизонты генетики. Но прежде чем мечтать о модификации человеческого генома, Бергу нужно было решить техническую задачу: найти способ внедрить чужеродный ген в геном вируса. Требовалось искусственно сотворить генетическую химеру — гибрид вирусной и чужой ДНК. 

В отличие от генов человека, которые распределены по линейным хромосомам, как нанизанные на гитарные струны бусины, гены SV40 собраны на кольцевой ДНК. Такой геном подобен молекулярному ожерелью. Когда вирус заражает клетку и вносит свои гены в ее хромосомы, «застежка» раскрывается, «ожерелье» распрямляется и внедряется в клеточную ДНК. Чтобы вставить чужой ген в геном SV40, Берг должен принудительно открыть застежку, прикрепить ген и заново соединить концы ожерелья. Остальную работу вирус: он перенесет ген в клетку и вставит его в человеческую хромосому .  

Берг не был единственным биологом, размышлявшим над размыканием и смыканием вирусной ДНК для вставки чужих генов. Питер Лоббан, аспирант из соседней лаборатории в Стэнфорде, в 1969-м писал диссертацию и планировал похожие генетические манипуляции с другим вирусом. До Стэнфорда Лоббан учился в Массачусетском технологическом институте (МТИ) и был инженером по образованию — или, точнее, по складу ума. Свои исследовательские планы он обосновывал тем, что гены ничем не отличаются от стальных стержней: их так же можно перепрофилировать, изменить, подогнать под требования человека и пустить в работу. Главное — найти для каждой затеи подходящий инструментарий. Под научным руководством Дейла Кайзера Лоббан даже провел предварительные эксперименты, в которых для переноса генов из одной молекулы ДНК в другую пытался использовать ферменты из стандартного биохимического арсенала.  

На самом деле главный секрет — Берг и Лоббан вычислили его независимо друг от друга — заключался в том, чтобы забыть о вирусной природе SV40 и обращаться с его геномом как с простым химическим веществом. Гены в 1971-м, может, и были «недосягаемы», но вот ДНК была доступна совершенно. Эвери, в конце концов, даже вываривал ДНК в раствор как простое вещество, и она все равно передавала информацию между бактериями. Корнберг добавлял к ней ферменты и заставлял реплицироваться прямо в пробирке. Все, что было нужно Бергу для внедрения гена в SV40, — это провести серию реакций. Один фермент должен был раскрыть геномное ожерелье, а другой — «вклеить» в него фрагмент чужеродной ДНК. Возможно, после этого вирус (или, скорее, его информационный посыл) вернулся бы к жизни. 

Но где искать ферменты, способные резать и вставлять ДНК? Ответ, как то часто случалось в истории генетики, пришел из мира бактерий. С 1960-х микробиологи выделяли бактериальные ферменты, пригодные для манипуляций с ДНК в пробирке. Клетка бактерии — да и любая другая на самом деле — нуждается в собственном «наборе инструментов» для управления ДНК: каждый раз, когда клетка делится, восстанавливает поврежденные гены или переносит гены между хромосомами, она использует ферменты для копирования генов и заполнения утраченных участков.  

«Склейка» двух фрагментов ДНК просто не могла не входить в этот обязательный набор реакций. Берг знал, что даже примитивнейшие организмы умеют соединять свои гены. Цепи ДНК, напомню, могут рваться под действием агрессивных факторов вроде ионизирующего излучения. Поломки ДНК происходят в клетках постоянно, и для их починки клетка производит специальные ферменты, способные сшивать разорванные участки. Непосредственно этим занимается фермент под названием «лигаза» (от лат. ligare — связывать): он создает химическую связь между двумя фрагментами расколовшегося остова ДНК, восстанавливая целостность двойной спирали. Фермент «полимераза», который осуществляет копирование ДНК, вовлекается в починку сломанных генов, если нужно заполнить «прорехи».  

А вот режущие ферменты пришлось добывать из более необычного источника. Практически у всех клеток есть лигазы и полимеразы для восстановления поврежденной ДНК, при этом у большинства клеток нет веских доводов иметь «в свободном выгуле» фермент, разрезающий ДНК. Однако бактерии — организмы, выживающие в самых неблагополучных задворках природы, где ресурсы катастрофически ограничены, борьба за существование обострена, а соседи суровы, — вынуждены были обзавестись такими ножеподобными ферментами для защиты от вирусов. Эти ферменты, будто выкидные ножи, распарывают ДНК захватчика, и атака проваливается. Такие белки назвали «ферменты рестрикции» (ограничения), потому что они ограничивают заражение некоторыми вирусами. Эти молекулярные ножницы узнают определенную последовательность нуклеотидов и разрезают двойную цепь в строго определенном месте. Специфичность — это главное: в молекулярном мире прицельный удар в уязвимое место может стать летальным. Микробы парализуют молекулярных вторженцев, разрезая их информационные цепи.  

Этот ферментный инструментарий, заимствованный у микробов, должен был стать основой экспериментов Берга. Ученый знал, что ключевые компоненты для генной инженерии лежат в пяти морозильных камерах пяти разных лабораторий. Ему требовалось лишь пройти по лабораториям, собрать ферменты и выстроить цепь реакций. Разрезать одним ферментом, склеить другим. Любые два фрагмента ДНК можно будет сшивать, и ученые смогут манипулировать генами невероятно изящно и ловко.  

Берг осознавал значение рождающейся технологии. Гены можно будет объединять, создавая новые комбинации или комбинации комбинаций; их можно будет перекраивать, изменять действием мутагенов и тасовать между организмами. Ген лягушки, к примеру, можно вставить в геном вируса и таким образом ввести его в клетку человека. Человеческий ген можно передать бактериальной клетке. Если развить технологию до крайности, гены станут бесконечно податливыми: мы сможем создавать новые мутации или стирать старые; не исключено, что мы покусимся даже на наследственность — научимся отмывать ее метки, вычищать их, изменять на собственное усмотрение. Берг вспоминал относительно своих генетических химер, что «ни одна из отдельных процедур и манипуляций, ни один из реагентов, использованных для создания рекомбинантной ДНК, не были новыми; новизна заключалась в особой схеме их комбинирования». Воистину решающим прорывом стало нарезание и сшивание идей — перегруппировка и сплавление знаний и методик, уже почти десятилетие существовавших в области генетики. 

Зимой 1970 года Берг и Дэвид Джексон, выполнявший постдокторантское исследование в лаборатории Берга, предприняли первые попытки разрезать и соединить два кусочка ДНК. Это были утомительнейшие эксперименты — «кошмар биохимика», по словам Берга. Необходимо было очистить ДНК, смешать ее с тем или иным ферментом, еще раз очистить в охлажденных колонках, а затем повторять процесс до тех пор, пока каждая реакция не пройдет безупречно. Проблема заключалась в том, что работа режущих ферментов — рестриктаз, если кратко — не была оптимизирована, и эффективность реакции оказывалась мизерной. Лоббан, занятый конструированием собственных генных гибридов, тем не менее продолжал снабжать Джексона важными техническими идеями. Он придумал способ добавлять на концы сшиваемых молекул маленькие фрагменты ДНК, чтобы получались как бы две части застежки, смыкающиеся по принципу комплементарности. Эти «липкие концы» значительно повышали эффективность формирования генетических гибридов.  

Несмотря на мучительные технические препятствия, Берг и Джексон сумели соединить целый геном SV40 с фрагментом ДНК бактериального вируса лямбда (бактериофага λ) и тремя генами бактерии E. coli.  

По тем временам это было выдающееся достижение. Хотя и фаг λ, и SV40 — вирусы, они отличаются друг от друга так, как, скажем, конь и морской конек: SV40 проникает в клетки приматов, а λ заражает исключительно бактерий. Ну а E. coli — это и вовсе другая «зверюшка» — бактерия из человеческого кишечника. В итоге вышла странная химера: в единую молекулу ДНК были сшиты гены с далеких ветвей эволюционного древа. 

Берг назвал гибрид рекомбинантной ДНК. Этот осмотрительно выбранный термин отсылал к естественному феномену рекомбинации — к образованию гибридных генов в ходе полового размножения. В природе генетическая информация нередко перемешивается между хромосомами для повышения разнообразия. Участок ДНК мужской хромосомы меняется местами с аналогичным участком женской, образуя «отцовско-материнский» генный гибрид — Морган назвал этот феномен кроссинговером, то есть пересечением. Берг, создавая свои гибриды с помощью тех же инструментов, которые в естественных условиях разрезают, соединяют и чинят гены, расширил принцип кроссинговера, вывел его за рамки размножения. Он получал такие же гибриды, но из генетического материала разных организмов, смешивая его в пробирке. Рекомбинация без репродукции: Берг пересек границу, за которой простирался новый биологический космос.

Той зимой к команде Берга решила присоединиться аспирантка Джанет Мерц. Она не стеснялась высказывать собственное мнение, была упорной и «чертовски умной», как описывал ее Берг. Мерц представляла собой аномалию в мире биохимиков: она была одной из двух женщин, связавших свою жизнь со стэнфордской кафедрой биохимии за 10 лет ее существования. Как и Лоббан, Мерц пришла в Стэнфорд из МТИ, где обучалась инженерии и биологии. Ее заинтересовали эксперименты Джексона, и она увлеклась идеей создания химер из генов разных организмов. 

Но что, если «вывернуть» экспериментальную цель Джексона? Он внедрял генетический материал бактерии в геном SV40. А что, если Мерц сконструирует гибрид с генами SV40 в геноме E. coli, то есть не вирус будет нести бактериальные гены, а наоборот?  

Эта инверсия логики — или, скорее, инверсия объектов — давала значительные технологические преимущества. Как и во многих бактериях, в E. coli помимо хромосомы содержатся крошечные дополнительные молекулы ДНК, или плазмиды. Как и геном SV40, плазмиды — кольцевые структуры, ДНК-ожерелья, которые «живут» и размножаются копированием внутри бактерии. По мере увеличения бактериальной биомассы умножается и количество плазмид. Мерц поняла, что если бы ей удалось поместить гены SV40 в плазмиду E. coli, то можно было бы использовать бактерию как фабрику по наработке новых генных гибридов. Бактерия будет расти и делиться, и число плазмид с чужеродным геном многократно возрастет. Копии копий модифицированных молекул ДНК, нагруженных чужими генами, бактерия будет создавать сама. В конце концов образуются миллионы реплик фрагмента ДНК — . 

Подробнее читайте:
Мукерджи, Сиддхартха. Ген. Очень личная история / Сиддхартха Мукерджи : Пер. с англ. Ольги Волковой и Ксении Сайфулиной — Москва: Издательство АСТ: Corpus, 2023. — 688 с.