Лабораторный дневник

Эти десять дней я провела с сачком и микродозатором в руках: вместе с коллегами из США и Великобритании исследовала прибрежные экосистемы в рамках программы, организованной Морской биологической лабораторией в Массачусетсе. Как выглядел первый в моей жизни естественнонаучный проект, если не считать школьных опытов по биологии, физике и химии, рассказываю (и показываю) в этом блоге.

Основная идея программы Logan Science Journalism Program, на мой взгляд, — про эмпатию. Журналисты, которые постоянно пишут про науку, но никогда не задерживаются в лаборатории надолго, видят, как правило, только научные статьи — результат очень долгого пути и колоссальной работы, которая остается за кадром. За десять дней нельзя сделать из выпускницы экономического факультета МГУ (меня) эколога, но можно создать для этой выпускницы достаточно убедительную «песочницу», в которой показать, как работает научный метод, откуда и как берутся исходные данные, которые затем анализируют ученые.

Проблема, которую нам предложили изучить, — вмешательство человека в азотный цикл и его последствия для прибрежных экосистем. Избыток азота в виде нитрат-иона NO₃^- и аммония NH₄⁺ от сточных вод и азотных удобрений с подземными водами попадает в водоемы, где концентрация азота является основным ограничителем биопродуктивности. Как только его становится больше, в водоемах буйно «расцветают» фитопланктон и водоросли, затем они гибнут, в процессе гниения забирая из воды кислодрод, что приводит к гипоксии и даже аноксии (возникновению так называемых «мертвых зон»). Прибрежные экосистемы — локальные очаги биологического разнообразия — страдают от этого особенно сильно.

Одна из многочисленных прибрежных экосистем полуострова Кейп-Код — залив Уокуойт (Waquoit). Выглядит он вот так:

Центральная часть — собственно залив, а вокруг него расположены пруды и устья рек разной степени населенности и, соответственно, загрязненности. Для анализа мы выбрали три места в заливе: самый верх устья реки Чайлдс, берега которой достаточно сильно застроены, относительно чистый и нетронутый пруд Сейдж-Лот и верхнюю часть залива как некую промежуточную точку. Нас интересовала азотная нагрузка в этих местах и ее влияние на разнообразие растительного и животного мира. Кроме того, перед нами поставили и очень прикладной вопрос, который впоследствии достался мне, так что я расскажу о нем чуть подробнее.

В ходе денитрификации бактерии и археи в несколько этапов восстанавливают нитраты до молекулярного азота — это очень удобно, если вы хотите бороться с азотным загрязнением воды. Приручить денитрифицирующие микроорганизмы и поставить их на службу очистки подземных вод в заливе Уокуойт попытались с помощью двух проницаемых барьеров из щепок (это источник углерода для бактерий), закопанных на глубине полутора-двух метров недалеко от береговой линии. Естественно, пока это сугубо научный проект, предназначенный для испытания перспективной технологии эффективного и достаточно дешевого способа очистки грунтовых вод: два барьера общей длиной в 32 метра не спасут огромный залив от лишнего азота. Барьеры установили в 2005 году, и вскоре после установки специалисты MBL показали, что они действительно работают, то есть концентрация NO₃^- в пробах до барьера существенно выше, чем после. Нашей задачей было проверить, как обстоят дела 14 лет спустя.

Программа построена так, чтобы журналисты оценили все разнобразие исследовательского процесса — от полевых работ и лаборатории до обработки данных и презентации на мини-симпозиуме (разве что научную статью писать не надо). Поэтому после вводных лекций и прочтения пачки научных работ толщиной в сантиметр (я не преувеличиваю) мы отправились в залив.

Кажется, что задача у нас была несложная, особенно на шестерых взрослых людей под руководством трех научных сотрудников: надо было всего лишь взять пробы подземных вод выше и ниже барьеров и пробы воды из реки и залива, а также собрать со дна пробы водорослей и беспозвоночных. На деле мы, разумеется, сразу же забыли ключи от моторной лодки и вспомнили об этом только на полпути к заливу.

Проба грунтовых вод берется так: вы втыкаете в землю полый штырь на достаточную глубину (сантиметров 50-60 в нашем случае) и небольшим ручным насосом выкачиваете немного воды, затем фильтруете ее и разливаете по пластиковым баночкам. Звучит легко, но штырь надо вколотить в землю (это не так просто), а насос требует довольно существенной силы рук и постоянно выходит из строя (а крошечный болтик вы тут же роняете в песок на берегу). Добившись-таки от земли какого-то количества воды, вы должны проверить ее соленость рефрактометром, чтобы убедиться, что перед вами действительно пресная грунтовая вода. В рефрактометре ничего толком не видно, а в половине случаев вы забываете им воспользоваться и, конечно же, обнаруживаете, что выкачали океаническую воду, ровно перед тем, как поставить готовые пробы в холодильник. Но, допустим, вам повезло, и вода пресная: ее надо шприцем прогнать через фильтр со сменной фильтрующей бумагой (менять после каждого образца) и разлить по баночкам, предварительно промыв этой же водой шприц, фильтр и баночки (а последние еще надо в какой-то момент подписать, не перепутав обозначение места и не сбившись с нумерации, ведь работают одновременно шесть человек). Да, холодильник, ящик с инструментами и двухметровый металлический штырь надо носить с собой от точки к точке.

Научные руководители сказали мне, что есть виртуозы, которые собирают пробы в одиночку, но это действительно требует нечеловеческой ловкости рук: даже качать воду и одновременно держать в руке пластиковую колбу для нее довольно трудно. Так мы узнали первый из многих лайфхаков этой недели, позу волынщика, когда колбу прижимаешь к себе как волынку, а руками при этом держишь насос. Пробы в открытой воде собирать чуть проще: для этого надо всего-то опустить руку в воду глубже локтя, держа пластиковую бутылку строго вертикально горлом вниз, чтобы в ней до последнего момента оставался воздух, и развернуть ее, набрав воды не с самой поверхности. Первую воду выливают, чтобы промыть контейнер, а со второй пробой его подписывают и упаковывают в холодильник.

Так вшестером, в позе волынщика, стараясь не вывалиться за борт небольшой лодки, за два дня работы мы собрали 39 проб. В среднем для нормального качественного исследования собирают более тысячи таких проб.

Помимо воды, нам были нужны водоросли и беспозвоночные. Для водорослей пришлось вооружиться полуавтоматическим дночерпателем — ковшом Экмана, который при неуважительном обращении может и отхватить подвернувшиеся конечности. Ковш Экмана — это металлический шест с металлической же коробкой на одном из концов, заостренные створки которой резко смыкаются при нажатии на ручку на другом конце. Дночерпатель опускают на дно, жмут на ручку и затем вытаскивают несколько килограммов грязи и, хочется верить, образцов водорослей. Образцы, если они есть, тщательно промывают, упаковывают в подписанные пакеты и кладут в холодильник. После водорослей надо озаботиться беспозвоночными: в заливе Уокуойт это морские улитки, рачки, голотурии, оболочники и прочая живность, а если повезет, то и крабы.

На реке Чайлдс и в самом заливе сбор проб прошел без происшествий, хотя на берегах реки нам так и не удалось найти ни одной живой беспозвоночной души (души потом обнаружились в донных пробах). А вот в пруду Сейдж-Лот оказалось, что прилив слишком высокий, и даже специальные водонепроницаемые штаны до подмышек не позволяют дойти туда, где начинается нужный нам взморник, морская трава Zostera marina. Только спустя час блужданий по пояс в пруду мы смогли найти место, где ковш Экмана захватывал растительность. Зато с животными — и это первый признак более здоровой экосистемы — там проблем не было никаких: улиток можно было собирать горстями, а гоняться с сачком за крабами было даже весело (под конец мы стали отпускать пойманных, потому что проб было слишком много).

После двух дней общения с клещами — их было столько, что если я не получила болезнь Лайма, это будет главным достижением программы — мы вернулись в лабораторию. Но прежде чем переходить к пробиркам и микродозаторам, надо разобрать девять проб водорослей по видам — вручную, пинцетом (еще один лайфхак: двумя пинцетами значительно удобнее), тщательно очищая от грязи и прикрепленных к ним чьих-то яиц. На это крайне медитативное занятие у нас ушло три с лишним часа, в итоге получилось 70 (семьдесят) проб шести видов водорослей и взморника, а также пара десятков проб животных. Все эти пробы надо было высушить в печи и взвесить, а часть перемолоть в тонкую пыль в ступке, чтобы затем отправить в масс-спектрометр. Пока мы ездили смотреть на китов, доблестный техник по имени Маршалл вышел на работу в воскресенье, чтобы определить для нас δ¹³C и δ¹⁵N, соотношения тяжелых и легких изотопов углерода и азота в тканях растений и животных (о том, зачем это нужно, будет ниже).

В пробах воды нужно было определить концентрацию NO₃^- и NH₄⁺. Делали мы это с помощью спектрофотометра — прибора, оценивающего поглощение света (сначала для этого пробы NH₄⁺ надо окрасить, аккуратно добавив в них нужные реагенты, а NO₃^- еще и превратить в NO₂^-). Куда более умные люди выяснили, что между поглощением света и концентрацией заданного соединения есть зависимость, а значит, выяснив поглощение для проб, можно узнать и концентрацию.

Правда, сначала придется слегка напрячь математические мускулы. Дело в том, что на точные численные параметры этой зависимости может влиять множество показателей, в том числе малопредсказуемое качество реагентов, то есть нет никакого одного волшебного уравнения, в которое можно подставить поглощение и получить концентрацию. Это уравнение нужно получить самим, изготовив из своих же реагентов и деионизированной воды так называемые стандарты — набор растворов с заранее известной концентрацией — и на основе этих точек данных построить регрессию. То есть надо не запутаться с тем, как из одного раствора максимально точно развести шесть-семь других (впервые в жизни взяв в руки и откалибровав микродозатор, между прочим), смешать пробы с реагентами и терпеливо по одной подставлять пробирки спектрофотометру, следя за тем, чтобы тот случайно не захватил пузырек воздуха.

К облегчению всех вовлеченных лиц, NO₃^- за нас анализировала машина — цепочка из автосэмплера и подключенных к нему спектрофотометра и компьютера, который еще и сразу выдавал концентрацию, никаких дополнительных расчетов не требовалось. А вот NH₄⁺ я делала своими руками и трепетала в ожидании вердикта сначала спектрофотометра (сумела ли я с ним справиться), а затем Microsoft Excel (в котором делала график зависимости). Получилось вот так: чем ближе R² к единице, тем точнее вы сделали свою работу):

Пока я по капле добавляла деионизированную воду в пробирки, чтобы точно набрать 100 миллилитров, мои коллеги поместили живые, не побывавшие в печке водоросли родов Gracilaria и Ulva в специальную климатическую камеру для роста растений. В ней мы датчиками кислорода замеряли фотосинтез и дыхание, чтобы понять, сколько кислорода водоросли производят, а сколько потребляют (для этого в камере имитируются день и ночь).

Итак, мы знаем концентрацию NO

и NH

в наших 39 пробах воды, δ

C и δ

N для проб живых организмов и даже потребление и производство кислорода водорослями. Что мы можем сделать с этими данными?

Во-первых, и для таких чайников, как мы, это, пожалуй, самое важное, надо проверить, что наши данные соответствуют имеющимся знаниям и здравому смыслу. Например, мы достоверно знаем, что экологическая обстановка в реке Чайлдс существенно хуже, чем в пруду Сейдж-Лот, поэтому стоит ожидать, что и концентрация нутриентов, и биомасса водорослей там будут больше. Еще один хороший признак — требовательную к качеству окружающей среды Zostera marina мы нашли только в пруду, как и ожидалось. Во-вторых, барьеры для очистки воды от NO₃^- даже теоретически не могут ухудшать ситуацию, то есть концентрация нитрат-иона в воде должна падать после прохождения барьера, а не расти. Мы знаем, что в светлое время суток водоросли нетто-производят кислород (вдыхают меньше, чем фотосинтезируют), а в темное — только дышат им, и линия на графике концентрации кислорода в воде должна выглядеть как крыша домика. Наконец, мы примерно знаем, какие значения δ¹³C и δ¹⁵N мы должны получить для растений и животных, побывавших в масс-спектрометре сотни и тысячи раз, и было бы странно, если бы мы поймали что-то совершенно особенное. Кроме того, соотношение тяжелого и легкого изотопов углерода в пищевой цепочке практически не меняется, а вот соотношение тяжелого и легкого изотопов азота должно расти (¹⁵N накапливается в организмах) — это мы тоже должны увидеть. Так выглядят некоторые диаграммы из нашей презентации по итогам курса:

Во-вторых, мы можем попытаться ответить на наш очень прикладной вопрос о том, работают ли барьеры. На первый взгляд — да, работают, во всяком случае, расположенный в самом заливе, там разница довольно заметная:

Но так как я слегка травмирована высшим экономическим образованием и двумя семестрами эконометрики, мне подавай статистические тесты на значимость этой разницы. Для наших целей подойдет, например, t-тест, который позволяет проверить гипотезу о равенстве матожиданий двух генеральных совокупностей (если матожидания концентрации NO₃^- до и после барьера одинаковые, то барьер не работает — концентрация не меняется). Рассчитала я односторонний (потому что барьер не может ухудшать ситуацию, помните?) двухвыборочный t-критерий для независимых выборок с разными дисперсиями (потому что нет оснований считать дисперсии одинаковыми) и получила, что барьер залива Уокуойт действительно работает (p = 0.01441), а о барьере реки Чайлдс этого сказать нельзя (p = 0.26469).

Казалось бы, на этом можно было остановиться, но журналисты в некоторых смыслах не менее дотошны, чем ученые: если мама журналиста говорит ему, что любит его, журналист идет к фактчекеру. К счастью, наш миниатюрный научный эксперимент с недавнего времени проводят каждый год, и я попросила у научных руководителей данные прошлогодней группы:

Класс 2018 года не делал t-тест, его по исходным данным я сделала сама и выяснила, что с точки зрения статистики в 2018 году, наоборот, работал барьер реки Чайлдс (p = 0.05056), но не барьер в заливе (p = 0.14557). Интересно, что, несмотря на довольно резкий перепад концентрации, с 85 до 2, разница для залива Уокуойт оказалась незначимой: судя по всему, проблема в очень высокой вариации показателя (в большинстве проб концентрация исчислялась единицами микромолей на литр, но в одной пробе — аж 440, кажется, металлическим штырем для проб воды коллеги попали куда-то не туда).

Итак, мы выяснили, что ничего не выяснили: барьеры вроде бы работают в том смысле, что концентрация NO₃^- после прохождения через них грунтовых вод все же снижается, но доказать это с помощью статистического кунг-фу мы не смогли. Главный вывод, конечно, в том, что пара десятков проб за два года просто не дадут вам достаточного количества информации — как любят писать авторы научных новостей, необходимы дальнейшие исследования.

Зачем каждый год тратить несметное количество денег на то, чтобы 12 журналистов (вторая группа биомедицинских стипендиатов занималась изучением митохондрий и эпителиально-мезенхимального перехода) поиграли в ученых? Во-первых, для MBL и всего научного кластера Вудс-Хоул это, несомненно, пиар-активность: параллельно с научной работой мы ходили на встречи с учеными и экскурсии, где нам то и дело ненавязчиво подбрасывали интересные темы для статей, непосредственно связанных с работой лаборатории.

Во-вторых, даже игрушечный опыт возни с пробами, микродозаторами и особо точными весами действительно помогает лучше понять, даже прочувствовать, сколько человеческого труда скрывается за разделом «Методы» в любой научной статье — а, значит, можно надеяться, что тексты о науке станут немного, но лучше, а журналисты хоть немного, но благосклоннее к ученым. И в-третьих, это инвестиции в инфраструктуру: многие научные журналисты не только пишут сами, но и преподают (как я, например, в ИТМО и ТюмГУ), и они обязательно передадут полученный опыт дальше.

А некоторые еще и напишут о своих приключениях в родное издание.