Их проверили на клетках и личинках данио-рерио
Химики из Великобритании создали семейство флуоресцентных зондов на основе борной кислоты и проверили их на живых клетках и на личинках рыбок данио-рерио. Один из зондов смог отличить личинки с генетически повышенным уровнем глюкозы от их здоровых собратьев без экзогенного сахара. Работа опубликована в журнале Advanced Science.
Борная кислота обратимо связывается с молекулами, которые содержат 1,2- и 1,3-диолы, и именно так устроены почти все сахара, от небольшой глюкозы до крупных полисахаридов. Это свойство давно используется как основа химических сенсоров на сахар: если к борной кислоте пришить флуоресцентный краситель, связывание с сахаром может менять яркость или цвет свечения такого зонда. В отличие от ферментных сенсоров на глюкозу, борная кислота не расходуется в реакции и не портится со временем, поэтому такие зонды в теории можно использовать для непрерывного отслеживания сахара прямо внутри живых клеток и организмов, что важно, например, для изучения диабета или онкологических заболеваний, при которых обмен сахаров в клетках нарушен.
Тони Джеймс (Tony D. James) из Университета Бата с коллегами собрали целое семейство из шести таких зондов, отличающихся деталями конструкции. В зондах 1 и 2 борная кислота напрямую пришита к флуоресцеину — распространенному зеленому красителю, зонд 3 построен на родамине, более устойчивом к выцветанию красителе того же класса. Зонд 4 собран без борной кислоты, вместо нее он несет биотин (витамин, который очень прочно связывается с белком авидином), благодаря чему служит контрольной молекулой — с помощью него можно проверить, действительно ли именно борная кислота отвечает за проникновение в клетку. Зонды 5 и 6 совмещают борную кислоту и биотин, прикрепленные к флуоресцеину через более гибкий или жесткий органический мостик. Отдельно зонд 6 посадили на поверхность магнитных наночастиц оксида железа в оболочке из кремнезема, используя способность борной кислоты связываться с гидроксильными группами на поверхности кремнезема.
Чтобы разобраться, как зонды ведут себя внутри живых клеток, авторы использовали не только обычную флуоресцентную микроскопию, которая оценивает яркость зонда, но и микроскопию по времени жизни флуоресценции с двухфотонным возбуждением. Этот метод измеряет не яркость, а то, сколько именно времени молекула красителя остается в возбужденном состоянии перед тем, как погаснуть. Это время зависит от микроокружения красителя и почти не зависит от его концентрации, поэтому оно дает более надежные сведения о том, с чем именно краситель взаимодействует в данный момент внутри клетки, чем просто яркость свечения.
Опыты на различных культурах клеток (раковых HeLa, MCF-7 и PC-3, а также здоровых CHO и FEK-4) показали, что зонды с борной кислотой свободно проникают через клеточную мембрану. Зонд 5, например, со временем добирается и до митохондрий, а зонд 6 в здоровых клетках остается в основном на мембране и в цитоплазме. Контрольный зонд 4 без борной кислоты, напротив, почти не проникал в клетки за то же время — это подтверждает, что именно борная кислота отвечает за эффективное проникновение зондов сквозь мембрану. Зонды с биотином при этом действительно связывались с авидином, как и было задумано, а магнитная наночастица с зондом 6 на поверхности проникала в клетки практически так же, как и свободный зонд 6, без заметной дополнительной токсичности.
Проверив зонды на живых клетках, авторы перешли к личинкам рыбок данио-рерио — удобной модели для испытаний на целом организме. После подбора оптимальных условий зонды четко метили пищеварительную систему личинок, в первую очередь кишечную луковицу — аналог желудка у рыб. Зонды 2 и 3 светились в кишечнике заметно ярче зонда 1. При добавлении в воду свободной глюкозы свечение зонда 2 резко гасло, а свечение зонда 3, наоборот, усиливалось, то есть даже близкие по конструкции зонды реагировали на один и тот же сахар в противоположные стороны, и направление отклика определялось деталями молекулярной конструкции. Крупный полисахарид β-d-глюкан на свечение зондов почти не повлиял: в отличие от маленькой глюкозы, этот сахар не способен быстро и в неизменном виде проникнуть через стенку кишечника рыбки за время эксперимента.
Лучшее сочетание высокого захвата и сильного отклика на глюкозу показал зонд 2, и его авторы использовали для главной проверки: отличит ли зонд рыбок с повышенным уровнем глюкозы не от экзогенного сахара, а от эндогенного, генетически обусловленного. Для этого взяли личинок с мутацией в гене инсулина — у гомозиготных носителей такой мутации уровень глюкозы в организме примерно в десять раз выше нормы. Свечение зонда 2 в кишечнике таких рыбок оказалось значительно слабее, чем у гетерозиготных носителей мутации или обычных рыбок того же выводка, то есть зонд уловил повышенный уровень эндогенной глюкозы организма без всякого ее добавления снаружи.
Авторы заключают, что небольшие изменения в конструкции зонда, будь то выбор красителя, длина и жесткость связующего мостика, добавление биотиновой метки или посадка на наночастицу, заметно меняют характер проникновения зонда в клетку и определяют, куда он попадает внутри нее и как реагирует на сахар. Также удалось получить зонд способный различать здоровых и предрасположенных к диабету животных по эндогенной глюкозе. Свою работу они видят, как основу для будущих инструментов визуализации нарушений обмена сахаров при диабете и раке, а в перспективе — как платформу для поиска веществ, влияющих на усвоение углеводов клетками.
Если такие зонды получат уже для коммерческого применения, то, возможно, удастся объединить эту технологию с результатами исследования швейцарских ученых, о котором мы писали ранее. В нем исследователям удалось активировать выработку глюкагоноподобного пептида-1 при помощи светодиодов умных часов.