Японские биологи вырастили и успешно пересадили крысе органоид слезной железы из мультипотентных эпителиальных клеток глаза. Как сообщается в журнале Nature, этот органоид имеет сходство со слезными железами по морфологии, иммунным маркерам и экспрессии определенных генов.
Слезная железа — главная экзокринная железа глаза. Она секретирует слезную жидкость — важнейший компонент слезной пленки и различные защитные белки, например, лактоферрин, лизоцим, которые участвуют в противомикробной защите.
Клетки слезной железы плода способны к регенерации, однако у взрослых людей эта активность минимальна. Изучать эту железу трудно, потому что орган недоступен для биопсии и выделения клеток. Поэтому железа выступает мишенью для разработки лекарств и исследований в области регенеративной терапии.
Рюхэй Хаяси (Ryuhei Hayashi) и Тору Окубо (Toru Okubo) из Высшей медицинской школы Университета Осаки в 2017 году вместе с коллегами рассказывали о созданном ими органоиде глаза — SEAM (self-formed ectodermal autonomous multi-zone). SEAM частично повторял механизмы развития настоящего глаза и содержал клетки-предшественники для клеточных линий глаза. Теперь они опубликовали статью, в которой рассказывают об органоиде слезной железы, выращенном из клеток SEAM.
На десятой неделе развития SEAM клетки, которые развивались в третьей зоне, начали продуцировать маркеры клеток глаза и клеток желез. Некоторые из клеток, выделявших маркеры желез начали почковаться и слабо ветвиться. Чтобы понять, являются ли эти клетки предшественниками для органоидов слезных желез, исследователи выделили их и выращивали в среде, содержащей ключевые факторы роста клеток желез.
На четвертый день развития в новой среде, выделенные клетки начали почковаться, на пятнадцатый сформировали несколько веточек, а спустя еще 39 дней образовалась трехмерная структура, похожая на ткань слезной железы. Исходя из этого, исследователи пришли к выводу, что клетки третьей зоны SEAM, которые содержат клетки глазной поверхности дают начало органоиду слезной железы.
После этого исследователи решили узнать какие именно клетки из третьей зоны SEAM являются предшественниками органоида слезной железы. Для этого они использовали метод проточной цитометрии с добавлением антител, которые взаимодействуют со стволовыми эпителиальными клетками глаза (анти-ITGB4, анти-SSEA-4 и анти-CD200). Анализ показал, что 90 процентов клеток отрицательны к CD200, в то же время 60 процентов положительны к ITGB4, и SSEA-4. В совокупности эти характеристики относятся к стволовым эпителиальным клеткам глаза. Поэтому исследователи пришли к выводу, что клетки, которые сформировали органоид слезной железы, относятся к линии стволовых эпителиальных клеток глаза. После этого авторы провели анализ всего SEAM и получили следующие результаты: приблизительно 70 процентов были положительны к CD200, и из оставшихся CD200- выделили четыре популяции клеток.
Эти популяции затем перенесли на среду для дальнейшего культивирования, и среди всех них только одна сформировала многоотростчатую форму. Поэтому исследователи решили, что эта клеточная линия является предшественником для органоидов слезных желез.
После подбора оптимальной среды для почкования и ветвления желез из этой клеточной линии исследователи провели анализ одноцепочечной РНК этих клеток. Он показал, что на 20 день развития клетки начали синтезировать функциональные белки слезных желез: липокалин-2 и β-дефензин. Кроме этого, сформировались крупные скопления клеток, таких как миоэпителиальные, ацинарные и протоковые.
Чтобы проверить гипотезу о том, что предшественники слезной железы, развились из стволовых эпителиальных клеток глаза, биологи провели покадровую микроскопию для наблюдения за формированием колоний и выявили две формы клеток: плоские и куполообразные. Исследуя гены связанные с развитием желез, исследователи поняли, что они в большей степени экспрессируются в куполообразных клетках. Также нокаут одного из этих генов показал снижение почкования и ветвления в железах. Обратная ситуация наблюдалась в плоских клетках: там в большей степени обнаруживались маркеры клеток предшественников роговицы. Эти данные указывают на то, что первоначальная гипотеза о происхождении предшественников слезной железы была верна.
После того как исследователи вырастили органоид слезной железы они трансплантировали его в соединительную ткань рядом с глазом крысы(ее слезная железа была предварительно удалена). Через четыре недели после операции, пересаженный органоид сохранился и сформировал структуры похожие на протоки. В отличие от органоидов, выращенных in vitro, пересаженные показали четкое формирование протоков на второй неделе, а на четвертой они стали более выраженными.
Лактоферрин продуцирующие клетки, которые не могли быть замечены in vitro, были обнаружены в некоторых частях пересаженного органоида. Анализ экспрессии генов после трансплантации показал, что у пересаженных по сравнению с не пересаженными экспрессия генов LYZ и LTF (кодируют белки слезной пленки), выросла в 3000 раз.
На основании полученных данных биологи пришли к выводу, что уровень экспрессии определенных генов и маркеров у пересаженного органоида и нативной слезной железы одинаковый.
По словам авторов статьи, полученные данные и успешная трансплантация открывают перспективы для исследований развития слезной железы и лечения некоторых заболеваний, например синдрома Шегрена. Кроме этого, такие выращенные органоиды могут применяться в разработке лекарств и исследования патологий слезных желез.
Ранее мы рассказывали о том, что группа ученых из Швейцарии заявила о том, что им удалось создать метод биопринтинга, который позволяет печатать органы большого размера.
Исмаил Юнусов