Химики нашли простой путь синтеза антивирусного препарата молнупиравира, применяемого при лечении ковида. Ученые использовали дешевую рибозу как исходное вещество и разработали биокаталитический процесс, позволивший синтезировать молнупиравир в три стадии. Выход лекарства увеличился в семь раз по сравнению с разработанным ранее синтезом. Исследование опубликовано в журнале ACS Central Science.
Молнупиравир — экспериментальный противовирусный препарат компаний Merck & Co и Ridgeback, который, согласно результатам третьей фазы клинических испытаний, уменьшает риск госпитализации и смерти пациентов с ковидом на 50 процентов. В настоящее время его получают в 10 стадий из рибозы и урацила с выходом продукта менее 10 процентов. Сильное снижение выхода связано с несколькими стадиями введения и снятия защитных групп, нужных для увеличения селективности превращений. Однако в живых организмах похожие на молнупиравир молекулы легко получаются без использования защитных групп с помощью биокаталитических модификаций рибозы.
Ученые под руководством Джона Макинтоша (John A. McIntosh) и Патрика Фиера (Patrick S. Fier) из фармацевтической компании Merck & Co поставили себе задачу разработать простой и прямолинейный путь синтеза препарата молнупиравира, основываясь на знаниях о биосинтезе схожих соединений. Схема получения должна была включать в себя как минимум три стадии: ацилирование рибозы, введение азотистого основания и превращение одной из его карбонильных групп в оксим. Из нескольких вариантов последовательности проведения трех реакций ученые выбрали тот, который позволял выделять стабильные продукты наиболее просто и эффективно. Авторы планировали начать синтез с известной реакции ацилирования 5-го положения рибозы, затем провести ранее неизвестную ферментативную реакцию с урацилом, а после этого превратить карбонильную группу урацила в оксим.
Химики начали исследование с поиска подходящих ферментов для проведения второй стадии, предполагая, что фермент MTR-киназа (5-methylthioribose kinase) позволит ввести в 1-ое положение ацилированной рибозы фосфатную группу, которая затем заместится под действием урацила в присутствии фермента уридинфосфорилазы. В результате нескольких скринингов ученым удалось найти подходящие ферменты и дополнительно увеличить их эффективность с помощью направленной эволюции.
Далее авторы столкнулись с проблемой разработки методики синтеза при больших загрузках (десятки граммов) исходных веществ. Им нужно было найти метод каталитической регенерации АТФ из АДФ после стадии фосфорилирования, а также избавиться от получающегося в ходе реакции замещения фосфата для смещения равновесия реакции в сторону продуктов. Химики решили проблему с помощью еще двух биокаталитических реакций. Они стали добавлять в реакционную смесь ацетилкиназу, катализирующую реакцию синтеза АТФ из АДФ и ацетилфосфата. Последний получался в реакции фосфата с пируватом в присутствии фермента пируватоксидазы. Так, побочно получающийся фосфат служил источником фосфатной группы для реакции фосфорилирования ацилированной рибозы и не накапливался в реакционной смеси.
В последней стадии синтеза главной задачей ученых был поиск нетоксичного активирующего реагента для превращения карбонильной группы в оксим под действием соли гидроксиламмония. В результате подбора условий оказалось, что гексаметилдисилазан в присутствии имидазола и гидросульфата аммония при 80 градусах Цельсия не только нужным образом активировал карбонильную группу, но и вводил две липофильные триметилсилильные группы в кольцо рибозы, что упростило выделение и очистку продукта. Введенные группы легко удалялись при изменении кислотности среды, что позволило провести последнюю стадию синтеза с практически количественным выходом.
Так, ученые разработали трехстадийный синтез молнупиравира, включающий в себя простые и нетоксичные исходные реагенты и несколько ферментов. Метод оказался эффективнее предыдущего примерно в семь раз и позволил получить препарат с общим выходом 70 процентов в расчете на рибозу. Чистота продукта после выделения превосходила 99,5 процентов. Кроме того, в ходе синтеза лекарства ученые разработали несколько ранее неизвестных удобных превращений.
Молнупиравир — не единственное эффективное лекарство от ковида. Ранее мы писали об исследованиях препарата «Паксловид» от компании Pfizer. Ученые показали снижение риска госпитализации при его приеме на 89 процентов.
Михаил Бойм