Американские исследователи значительно повысили эффективность и скорость регенерации трансгенных растений за счет экспрессии в них химерного белка GRF4—GIF1. Полученные трансгены пшеницы при этом не нуждались в экзогенных цитокининах для роста новых побегов, а готовые растения можно получить более чем в полтора раза быстрее. Результаты работы опубликованы в журнале Nature Biotechnology.
Несмотря на множество успешно полученных трансгенных сортов растений, генные инженеры все так же сталкиваются с трудностями при создании новых. Ключевая сложность — в низком морфогенетическом потенциале некоторых растений, из-за которого клетки каллуса не дифференцируются и, как следствие, не происходит регенерация целого растения.
Команда исследователей из Калифорнийского университета под руководством Хорхе Дубковски (Jorge Dubcovsky) попыталась решить эту проблему с помощью увеличения экспрессии белков, регулирующих дифференциацию тотипотентных клеток. Они обратили внимание на высококонсервативное среди голо- и покрытосеменных растений семейство факторов транскрипции GRF (growth-regulating factor) и его кофактора GIF (GRF-interacting factor). Экспериментируя с пшеницей (Triticum aestivum), ученые выбрали присутствующие в ней гомологи — GRF4 и GIF1.
Авторы предположили, что, поскольку именно комплекс GRF—GIF активно индуцирует дифференциацию и пролиферацию клеток каллуса, то гиперэкспрессия в пшенице химерного белка GRF4—GIF1 с коротким спейсером станет эффективным решением. В эксперименте ученые с помощью агробактерий трансформировали незрелые зародыши тетраплоидного сорта пшеницы Kronos векторами, кодирующими экспрессию химерного GRF4–GIF1 (а также GRF4 и GIF1 в виде отдельных белков). В контрольном условии исследователи использовали «пустой» вектор (то есть не содержащий целевой ген)
Ученые заметили, что из каллусов с GRF4—GIF1 не только эффективнее дифференцируются в новые побеги, но еще при этом они не нуждаются (вопреки предписанному стандартными протоколами) в добавлении экзогенных цитокининов — индукторов побегообразования.
Чтобы в этом убедиться, исследователи получили каллусные ткани из незрелых эмбрионов от пшеницы дикого типа (26 штук) и мутантных по GRF4–GIF1 (27 штук) в средах без добавления экзогенных цитокининов. Оказалось, что средняя эффективность регенерации трансгенов значительно выше (77,8 процента), чем у тканей из растений дикого типа (11,5 процента).
Чтобы проверить пригодность GRF4—GIF1 для трансформации растений с низким морфогенетическим потенциалом, ученые отредактировали геном растения с помощью CRISPR/Cas9, а также экспрессировали химерный белок GRF4–GIF1. Для этого незрелые зародыши пшеницы инокулировали агробактериями, несущими вектор, кодирующий белки GRF4—GIF1 и Cas9 и направляющую РНК.
Мишенью агробактерий стал ген Q (AP2L-A5) пшеницы, так как у нокаутных по этому гену растений характерный фенотип. В качестве контроля вновь выступили незрелые зародыши, инокулированные агробактериями с «пустым» вектором.
Эффективность регенерации достигла 93,7 процента (30 трансгенных растений на 32 инокулированных зародыша), а полученные растения по фенотипу и генотипу соответствуют мутантному типу с нокаутным Q.
Описанная система сможет ускорить и значительно облегчить работу генных инженеров по созданию новых трансгенных сортов растений без необходимости серьезно заботиться об эффективности регенерации. Авторы работы сообщили о заинтересованности коллег в системе GRF4—GIF1: по-видимому, уже в ближайшее время можно ожидать волну новых результатов с самыми разными видами и сортами растений.
Создание трансгенных растений остается популярным направлением генной инженерии. Не так давно российским ученым удалось встроить люминесцентную систему грибов в растения табака, создав таким образом не только мощный инструмент для изучения биохимии и физиологии растений, но и просто для красоты.
Наталия Миранда