Немецкие исследователи разработали метод доставки лекарств в наночастицах, при котором высвобождение препарата происходит внутри клетки только в присутствии специфических маркеров болезни. Основой для наночастиц стал гликопротеин муцин с присоединенными частично комплементарными друг другу молекулами ДНК, играющими роль межмолекулярных сшивок. «Ключом» для разрыва ДНК-сшивок в наночастицах и высвобождения лекарства в клетке может быть микроРНК, сверхэкспрессия которой наблюдается при некоторых видах рака. Работа опубликована в журнале ACS Nano.
Лечение рака часто осложняется тем, что лекарства нужно доставить непосредственно внутрь раковых клеток, только там препарат, достигнув терапевтических концентраций, будет эффективен. Но решив эту задачу, мы сталкиваемся с проблемой неспецифического воздействия лекарств — например, цитотоксическому воздействию химиотерапевтических препаратов подвергаются не только раковые клетки, для которых они предназначены, но и здоровые, что приводит к нежелательным реакциям (иммуносупрессия, желудочно-кишечные расстройства, потеря волос и так далее).
Джерен Кимна (Ceren Kimna) с коллегами из Мюнхенского технического университета и Королевского технического института в Швеции решила эту проблему с помощью внутриклеточной доставки лекарств в биополимерных наночастицах, которые раскрываются только в раковых клетках. В качестве полимерной основы исследователи выбрали гликопротеин муцин, так как его химическая природа позволяет по-разному его функционализировать и хорошо связываться как с отрицательными, так и положительно заряженными молекулами. К тому же, ранее проведенные исследования по использованию муцина как основы биоматериалов показали, что у млекопитающих он вызывает либо незначительный иммунный ответ, либо полное его отсутствие.
В качестве сшивающего агента авторы использовали частично комплементарные (8 пар нуклеотидов) другу другу короткие молекулы ДНК, к 5’-концам которых присоединены тиольные группы. Через них олигонуклеотиды образуют дисульфидные связи с цистеиновыми остатками на концах молекул муцина. В присутствии глицерина молекулы муцина обратимо конденсируются, при этом короткие ДНК получают возможность сблизиться и комплементарно связываться друг с другом, образуя ДНК-муциновую полимерную наночастицу, внутри которой может находиться доставляемое лекарство.
Для специфического высвобождения лекарственного препарата исследователи предлагают использовать комплементарные олигонуклеотиды с большей аффинностью к сшивающей короткой ДНК (то есть образующие с ней больше комплементарных пар). Таким образом за счет конкурентного взаимодействия триггерные олигонуклеотиды смогут разрывать связи между сшивающими ДНК, нарушая структуру наночастицы.
Чтобы определить эффективность интернализации (проникновения в клетки) наночастиц, исследователи использовали флуоресцентно меченые молекулы муцина и следили за их распределением в раковых клетках линии HeLa с помощью проточной цитометрии. Выяснилось, однако, что степень проникновения ДНК-муциновых наночастиц в клетки незначительна, что натолкнуло ученых на мысль о том, что всему виной поверхностный заряд частиц. Дело в том, что они в таком виде имеют отрицательный поверхностный заряд, как и отрицательно заряженные компоненты клеточной мембраны. Именно электростатические взаимодействия, вероятно, препятствовали проникновению наночастиц в цитозоль. Чтобы это преодолеть, авторы исследования решили покрыть наночастицы поликатионом, добавив в методику еще одну стадию — вторую конденсацию, на этот раз молекул полилизина (первый вариант) и хитозана (второй вариант). При этом они отмечают, что поликатионная составляющая наночастицы снизит минимальную необходимую концентрацию триггерных олигонуклеотидов, так как сама будет притягивать отрицательно заряженные молекулы нуклеиновых кислот.
Эксперименты показали, что наночастицы в полилизиновой оболочке лучше проникают в клетку, чем в хитозановой. Авторы предполагают, что чересчур большой положительный заряд хитозана заставляет наночастицы с ним застревать в отрицательно заряженной клеточной мембране, мешая полноценному проникновению (дзета-потенциалы для наночастиц, покрытых полилизином и хитозаном — +2,3 и +21,7 милливольт, соответственно).
Конечной целью работы авторы назвали создание наночастиц, способных к автономному высвобождению лекарств за счет клеточных, а не искусственных триггерных олигонуклеотидов. Для этого они подобрали в качестве сшивающей ДНК последовательность, комплементарную miR-21 (онкогенная микроРНК, гиперэкспрессия которой наблюдается в некоторых опухолевых клетках). Новая сшивающая ДНК (анти-miR-21) содержит 14 пар оснований, из них восемь — комплементарные между собой, а 11 нуклеотидов комплементарны miR-21.
Эффективность созданной системы проверили на уже упомянутой раковой линии клеток HeLa с высокой экспрессией miR-21 и на клетках NIH/3T3, где экспрессия miR-21 незначительна. За состоянием наночастиц следили по распределению флуоресцентно меченого муцина в клетках. Оказалось, что и в тех, и в других клетках наночастицы способны к интернализации, однако в здоровых клетках, где концентрация триггерных олигонуклеотидов (miR-21) низка, наночастицы оставались в конденсированном состоянии, тогда как в опухолевых клетках наночастицы раскрывались и флуоресцентно меченый муцин равномерно распределялся в цитозоле.
Исследователи отмечают специфичность высвобождения лекарственного препарата больных клетках, однако добавляют, что более эффективной и безопасной предложенная система может быть при сочетании ее с таргетной доставкой наночастиц — таким образом, чтобы те не только специфически высвобождали терапевтические агенты внутри раковых клеток, но и специфически в них проникали.
Разработки биоинженеров все больше вселяют оптимизм и позволяют надеяться на изобретение новых эффективных, а порой неожиданных методов лечения болезней. О том, кто и как в России создает биоматериалы мы писали в этом материале.
Наталия Миранда