Исследователи из Медицинского института Говарда Хьюза доработали методику флюоресцентной микроскопии таким образом, что с ее помощью стало возможным снимать с высоким разрешением динамические процессы, происходящие в живом организме. Возможности микроскопии светового листа, совмещенной с адаптивной оптикой (AO-LLSM), ученые продемонстрировали в статье в Science. Пример визуализации процессов, например, съемки передвижения иммунных клеток в эмбрионе рыбки, представлены в редакционной статье Nature.
Расширение возможностей световой микроскопии, в частности, разработка флюоресцентной микроскопии высокого разрешения, сегодня позволяет рассматривать даже трехмерные фрагменты живых тканей. Пионерские работы по преодолению дифракционного предела разрешения светового микроскопа и разработке методов неинвазивной флюоресцентной визуализации принадлежат Эрику Бетцигу, Штефану Хеллу и Уильяму Мернеру. За свои достижения эти ученые были удостоены Нобелевской премии по химии в 2014 году.
Одна из последних разработок Бетцига — флюоресцентная микроскопия плоскостного освещения (light sheet fluorescence microscopy) — позволяет визуализировать объемные живые биологические образцы в течение длительного времени. Ее модификация, микроскопия светового листа с дискретным освещением (lattice light sheet microscopy — LLSM) позволяет добиться визуализации быстрых динамических процессов. В основе этих методов лежит быстрое сканирование образца тонким плоским пучком света, которое позволяет накапливать большое количество двумерных изображений, которые затем объединяют в трехмерную модель.
Тем не менее, эти методы имеют свои ограничения. Так, неоднородность окружающих тканей вносит искажения при детекции сигнала, что уменьшает разрешение картинки. Даже в отсутствие искажений высокое разрешение требует высокой интенсивности облучения, которое может повредить живой образец. Поэтому получение самых качественных изображений все равно требовало фиксации и специальной подготовки образцов.
В новой публикации команда Бетцига смогла обойти эти ограничения и представила комбинированную технику микроскопии, при помощи которой ученые смогли пронаблюдать за множеством разных процессов прямо в живом организме. Так, авторы засняли движение клатриновых пузырьков, динамику клеточных органелл, рост отростков нервных клеток в формирующемся спинном мозге и перемещение иммунных клеток в эмбрионе модельной рыбки данио-рерио. К примеру, на представленном ниже видео показана миграция клеток иммунитета в перилимфатическое пространство внутреннего уха эмбриона.
Для улучшения метода LLSM ученые использовали методы адаптивной оптики, применяемые в конструировании наземных астрономических телескопов. Авторы измеряли величину искажений при детекции специальной флюоресцентной метки и корректировали их изменением формы адаптивного зеркала. Комбинированная техника получила название AO-LLSM. Уменьшить фототоксичность пучка удалось при помощи ограничения освещения только тонкой плоскостью образца без облучения его основного объема.
Авторы работы надеются, что их разработка поможет сделать качественный скачок в исследовании клеток в их естественном окружении. Сейчас инженеры работают над уменьшением стоимости и увеличением компактности микроскопа, который, по их словам, пока занимает трехметровый стол.
Нобелевская премия по химии 2017 года была вручена за развитие технологий микроскопии. Методы криоэлектронной микроскопии позволяют разрешить структуру белков и макромолекулярных комплексов без их кристаллизации. Подробнее почитать об этом комплексе методов можно в нашем материале «Тени во льду».
Дарья Спасская