Ученые с помощью технологии редактирования генома CRISPR/Cas9 сумели в эксперименте на мышах задержать развитие симптомов неизлечимого нейродегенеративного заболевания — бокового амиотрофического склероза (болезнь Лу Герига) и улучшить выживаемость животных на 25 процентов. О результатах исследования говорится в статье, опубликованной в журнале Science Advances.
Боковой амиотрофический склероз (БАС, ALS) разрушает двигательные нейроны, что приводит к прогрессирующей мышечной слабости, дегенерации мышц, и, в конечном итоге, к параличу и смерти в течение трех-пяти лет после возникновения симптомов. Известны только два случая, когда течение болезни стабилизировалось — так произошло с физиком Стивеном Хокингом и гитаристом Джейсоном Беккером.
Лекарства позволяют отсрочить летальный исход, но лишь на несколько месяцев. В пяти-десяти процентах случаев болезнь наследуемая, и часть таких случаев (от 12 до 20 процентов) связывают с мутациями в гене SOD1. С помощью мутации в этом гене ученые создают модели болезни на животных, и у этих животных развивается прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, которое повторяет признаки БАС: дегенерацию нейронов, истощение мышц и паралич. С другой стороны, поскольку известен конкретный ген-«виновник», с помощью технологии CRISPR/Cas9 можно попытаться его «починить», мы уже сообщали об определенных успехах в лечении БАС на отдельных клетках. Группа ученых из университета Беркли решила пойти дальше, и под руководством Дэвида Шеффера (David Schaffer) решила испытать CRISPR/Cas9 на модельных животных, мышах с БАС, нарушив экспрессию SOD1 в их спинном мозге.
Новорожденным мышам с мутацией ввели комплекс нуклеазы Cas9 и направляющей РНК (sgRNA), которая нацеливается на нужный ген (hSOD1, взятый от человека). После инъекции поведение мышей наблюдали, отслеживая темпы наступления болезни, массу тела, и сохранность моторных функций. Через четыре недели после инъекции у них брали образцы тканей, и отправляли на дальнейший анализ. В тканях животных измеряли содержание мутантного белка и оценивали количество мутантных вставок в последовательность ДНК путем глубокого секвенирования.
Анализ лизатов (продуктов распада клеточных мембран) спинного мозга выявил трехкратное снижение мутантных белков в поясничном регионе у мышей, пролеченных с помощью CRISPR (P = 0.001), и их снижение в 2,5 раза в грудной области (P < 0.05). Однако в шейном отделе спинного мозга разница оказалась не значимой (P > 0.5).
Глубокое секвенирование позволило обнаружить инсерции и делеции нуклеотидов (то есть мутации ДНК, изменения ее последовательности) трансгена hSOD1: их оказалось в семь раз больше в поясничной (P = 0.01) и в 14 раз больше в грудном отделе спинного мозга (P < 0.05) в группе CRISPR по сравнению с контролем. Разница в шейном отделе также оказалось не значимой (P > 0.05).
Что касается терапевтических эффектов, начало болезни (оно отсчитывалось по достижению животным максимального веса) наступило на 33 дня позже в экспериментальной группе, и варьировалось от 119 до 133 дней у обработанных животных по сравнению с 77 до 98 днями в контрольной группе (P = 0.0001). Средняя выживаемость увеличивалась на 28-30 дней у обработанных мышей, и варьировала от 142 до 167 дней жизни у обработанных животных по сравнению с 114 до 136 дней у контрольных животных (Р < 0,0001). Животные из группы CRISPR дольше держали здоровый вес, и оказались более активными, чем их «коллеги» из группы контроля (P < 0.0001), это выражалось в количестве витков колеса, в котором бегали грызуны. Кроме того, у грызунов оказалось на 50 процентов больше моторных нейронов, по сравнению с группой контроля.
Также ученые отмечают более медленные темпы потери веса после наступления болезни у группы CRISPR, а это свидетельствует о меньшей мышечной атрофии. Однако с момента наступления болезнь прогрессировала одинаково и в контрольной, и в CRISPR-группе, то есть летальный исход наступал одинаково скоро.
Таким образом, действие CRISPR/Cas9 привело к снижению в спинном мозге белка, кодируемого мутантным геном SOD1, а это способствовало выживаемости моторных нейронов, и положительному терапевтическому исходу. Прогресс болезни, однако, не замедлился, и ученые связывают это с действием астроцитов, которые избирательно убивают моторные нейроны, и на которые редактирование генов, судя по всему, действует недостаточно.
Существуют и другие гены, ответственные за БАС, и один из них нашли в прошлом году, на средства, собранные во время знаменитого флешмоба #icebucketchallenge. Также мы рассказывали о технологии CRISPR/Cas9 и CRISPR-системах вообще.
Анна Зинина