Сотрудники лаборатории Сергея Разина из Института биологии гена РАН в составе международной команды ученых модифицировали метод для определения трехмерной организации хромосом и применили его для изучения пространственной организации ДНК в зрелых яйцеклетках до и после оплодотворения. Статья опубликована в журнале Nature.
Высокий уровень сложности многоклеточных организмов определяется большим разнообразием типов клеток, выполняющих самые разные функции. Это разнообразие появляется в ходе дифференцировки клеток, которая происходит начиная с самых ранних стадий эмбрионального развития. Отправной точкой для развития и дифференцировки является зигота – клетка, которая образуется после оплодотворения яйцеклетки сперматозоидом. Несмотря на то, что половые клетки являются строго дифференцированными, зигота, образующаяся в результате их слияния, обладает свойством тотипотентности, т.е. способна дать начало любому типу клеток организма. В медицинской биотехнологии в настоящее время активно исследуется возможность обратить процессы клеточной дифференцировки и вернуть клеткам свойство тотипотентности, однако, несмотря на некоторые успехи, имеющихся знаний для этого пока недостаточно.
Известно, что в процессе «перезагрузки» клеток от дифференцированного состояния к базовому уровню происходит смена эпигенетического статуса ДНК. К эпигенетическим изменениям относятся не только химические модификации ДНК и связанных с ней белков, такие, как метилирование, но и изменение пространственной организации ДНК внутри ядра. Трехмерная структура генома во многом определяет работу отдельных генов, ведь у эукариот ген и его регуляторные элементы нередко находятся очень далеко друг от друга. Совсем недавно эту трехмерную структуру научились исследовать на уровне отдельных клеток, однако для половых клеток это было невозможно из-за крайне малого количества ДНК, доступного для анализа (напомним, что половые клетки обладают одиночным набором хромосом, т.е. в два раза меньшим количеством ДНК по сравнению с соматическими клетками). В своей работе российские ученые предложили модификацию основного на сегодняшний день метода для определения трехмерной структуры генома – Hi-C, что позволило работать не только с ДНК отдельных ооцитов, но и с ДНК отдельных ядер внутри зиготы сразу после оплодотворения.
Несмотря на то, что некоторые самые бросающиеся в глаза особенности организации хроматина (ДНК в комплексе с сопутствующими белками и РНК) можно различить в световой или электронный микроскоп, активное изучение трехмерной организации генома началось относительно недавно с изобретением в 2002 году метода 3С (Chromatin Conformation Capture, т.е. фиксация структуры хроматина). Суть его заключается в том, что клетки обрабатывают формальдегидом, который фиксирует комплексы ДНК с белком, затем ДНК в составе комплексов выделяют, при помощи ферментов разрезают на небольшие фрагменты и сшивают снова. В итоге у исследователя в руках оказывается библиотека гибридных фрагментов ДНК, в состав которых входят последовательности, которые в ядре были расположены рядом друг с другом. Дальше все зависит от методов анализа этой библиотеки – чем более производительные методы используются, тем больше информации можно получить.
Исходно метод 3С предполагал, что можно проверить взаимодействие двух конкретных участков в геноме («один с одним»). Однако его изобретатели быстро начали увеличивать количество букв С, добавляя новые этапы, упрощающие анализ библиотеки, что привело к появлению технологий 4С («circularized 3C», изучение взаимодействий «один со всеми»), 5С («3C carbon copy», «многие со многими») и наконец Hi-C (от «high-throughput С», при помощи которого можно исследовать «все со всеми» взаимодействия). Технология Hi-C позволяет проанализировать библиотеку полностью благодаря появлению высокопроизводительного секвенирования ДНК, хотя базовый принцип остался тот же самый, что и в 3С. С использованием Hi-C удалось построить трехмерные карты хромосом человека, и определить, что «активный» хроматин, гены в составе которого активно экспрессируются, и «неактивный» формируют в ядре два отдельных компартмента (А-В компартменты). Очередной прорыв в области изучения трехмерной организации генома случился в 2013 году, когда с появлением технологии single-cell sequencing (секвенирование единичной клетки) стало возможным изучить 3D-структуру хромосом в отдельной клетке. Однако этого по-прежнему было недостаточно для исследования ооцитов.
Стандартная методика Hi-C предполагает несколько этапов обогащения библиотеки с использованием модифицированных нуклеотидов, которые включаются в состав полученных фрагментов. В случае, когда исходного материала много, эти этапы помогают избавиться от ДНК, которая почему-то не прошла обработку на предшествующих стадиях. Однако если стартовое количество ДНК исчезающее мало, они приводят только к потере материала в ходе эксперимента. Авторы работы модифицировали протокол Hi-C, отбросив стадии, приводящие к потерям, и увеличили на порядок чувствительность метода, который они назвали single-nucleus Hi-C (Hi-C для единичного ядра). Для того чтобы оценить изменения, происходящие в структуре хроматина ооцитов, ученые сравнили ядра незрелых и зрелых ооцитов (яйцеклеток). Как и ожидалось, с созреванием ооцита хроматин становился более компактным и неактивным.
Ключевой эксперимент работы был призван дать ответы на вопросы, что происходит с хроматином при «перезагрузке» клетки после оплодотворения, наследуется ли состояние хроматина или формируется заново, а также отличается ли состояние хроматина в материнском и отцовском ядрах в составе зиготы, образовавшейся после оплодотворения яйцеклетки сперматозоидом (на стадии зиготы ядра сосуществуют в клетке и не сливаются).
Обнаружилось, что в составе как отцовского, так и материнского ядер можно выделить структуры первичных уровней организации – хроматиновые петли и так называемые топологически ассоциированные домены. Структуры более высокого порядка — А-В компартменты активного и неактивного хроматина в отцовском ядре детектировались слабо, однако, к удивлению исследователей, в материнском ядре они вообще не были заметны. Таким образом, авторы работы обнаружили, что зигота содержит ядро, находящееся в стадии интерфазы, т.е. неделящееся, но при этом без признаков компартментализации хроматина, что среди всех тканей и клеток млекопитающих является уникальным случаем. Исходя из этих данных, предполагается, что формирование компартментов в ядрах происходит по-разному – в материнском они формируются заново, а в отцовском наследуются, либо формируются раньше. Кроме того, на основании полученных структур и компьютерных симуляций можно предположить, что организация хроматина в материнском ядре ближе всего к организации метафазной хромосомы, т.е. материнское ядро зиготы ближе к соматической клетке, чем дифференцированный ооцит или сперматозоид. Наконец, эти данные свидетельствуют о том, что разные уровни организации хроматина (а именно петли и А-В компартменты) формируются по разным механизмам.
Хочется отметить, что подобного уровня работы стали осуществимы благодаря взрывному развитию технологий анализа ДНК и РНК буквально за последние несколько лет. Теперь авторы работы хотят дополнить свою работу анализом экспрессии генов и метилирования ДНК на уровне единичной клетки, а нам остается только удивляться и ждать, какие еще возможности сегодня-завтра подкинет ученым прогресс.
Дарья Спасская