Немецкие ученые разработали метод микроскопии молекул в живых клетках с высоким пространственным разрешением. Результаты работы опубликованы в журнале Nature Methods.
Микроскопия молекул в живой клетке значительно осложнена тем, что они пребывают в постоянном движении. Необратимая химическая фиксация не позволяет наблюдать молекулярные процессы в динамике, неэффективна для иммобилизации мембран, может приводить к экстракции белков и искусственной кластеризации макромолекул.
Сотрудники Института молекулярной физиологии Общества имени Макса Планка, Дортмундского технического университета и Фраунгоферовского института биомедицинской техники разработали метод обратимой фиксации клеток постепенным охлаждением до −45 градусов Цельсия. Скорость охлаждения в эксперименте составила от 35 до 50 градусов в минуту, а последующего нагревания — от 75 до 130 градусов в минуту.
Для предотвращения кристаллизации льда, гибельной для клетки и рассеивающей свет, биоматериал обрабатывали диметилсульфоксидом (ДМСО). Это вещество хорошо проникает в клетку, малотоксично при низких температурах и вызывает образование сиропообразного аморфного льда (этот процесс называется витрификацией). Чтобы ДМСО не навредил биоматериалу, его концентрацию постепенно увеличивали и уменьшали в ходе охлаждения и согревания.
Такая технология позволяет проводить криофиксацию одной и той же клетки несколько раз, наблюдая за динамикой ее молекулярных процессов. Ученые продемонстрировали ее обратимость на разных клеточных линиях, добившись выживания 80 процентов клеток после трех циклов охлаждения.
В ходе экспериментов криофиксацию применили для изучения самосборки и активации рецепторных тирозинкиназ (РТК) в плазматической мембране, а также формирования их нанокластеров, усиливающих сигнал при взаимодействии с лигандом. РТК (в частности, рецептор эпидермального фактора роста EGFR, связанный с флуоресцентным белком) визуализировали при помощи флуоресценции полного внутреннего отражения и микроскопии локализованной фотоактивации (TIRF-PALM). Получение изображения этим методом требует нескольких минут, за которые при 37 градусах Цельсия рецепторы из-за диффузии смещаются на десятки микрометров. Криофиксация позволила детально рассмотреть их.
Кроме того, пятиминутная активация рецепторов эпидермальным фактором роста после одного цикла охлаждения вызвала эндоцитоз EGFR, который продолжался после двух дополнительных циклов, проведенных через 5 и 20 минут. Это подтверждает, что методика не наносит существенного ущерба молекулярным процессам в клетках.
«Жизнь всегда пребывает в движении, чтобы поддерживать себя, и ее невозможно визуализировать точно. Тем не менее, мы добились этого методом обратимой криофиксации. В узком смысле, мы преодолели биологический принцип неопределенности», — подытожил руководитель исследования Филиппе Бастиенс (Philippe Bastiaens).
Олег Лищук