Научная группа вирусологов под руководством Дидье Рауля (Didier Raoult) из Университета Экс-Марсель обнаружила аналог бактериальной противовиросной системы CRISPR/Cas у мимивирусов. Эти гигантские паразитические вирусы амеб были обнаружены всего несколько лет назад. Известно, что они страдают от собственных паразитов — вирофагов — и, судя по новым данным, могут использовать аналог CRISPR/Cas для самозащиты. Исследование опубликовано в Nature.
Мимивирусы представляют собой гигантские по меркам микромира вирусы, отдаленно родственные вирусу оспы. Они обладают очень большим геномом, превышающим по длине миллион пар оснований (для сравнения, геном кишечной палочки составляет 4,6 миллиона пар оснований, микобатерии — 580 тысяч пар). Вирионы (то есть частицы) мимивирусов окружены клеточной мембранной, а в их геноме обнаруживают большие куски «украденной» у хозяев ДНК, например очень редко встречающиеся у вирусов гены рибосомальных РНК. Паразитируют мимивирусы на свободноживущих пресноводных амебах рода Acanthamoeba, которые сами могут выступать в роли факультативных паразитов, например, вызывать энцефалит.
Вслед за открытием мимивирусов было обнаружено несколько других групп подобных гигантских бесклеточных организмов (мегавирусы, марсельвирусы, пандоравирусы). В 2008 году у одного из них удалось найти собственных паразитов, получивших название вирофагов — по аналогии с «пожирающими бактерий» бактериофагами (первыми вирофагами стали Sputnik1, Sputni2 и так далее). Позднее оказалось, что подобные вирофаги заражают и других гигантский вирусов. Кроме того, было обнаружено, что вирофаги сами содержат паразитические генетические элементы (получившие название трансповиронов), доводящие вложенность паразитизма до трех уровней.
Существование вирофагов у гигантских вирусов как раз и натолкнуло авторов новой работы на необходимость поиска иммунитета, с помощь которого те могли бы защищаться от паразитов.
Поиск проводился следующим образом. В качестве тестового вирофага ученые выбрали недавно открытый ими же вирофаг замилон (Zamilon). От более известных вирофагов типа Sputnik замилон отличается тем, что способен заражать только две из трех линий мимивирусов: B и С. Все имевшиеся в рапоряжении исследователей мимивирусы линии A оказались к замилону устойчивы.
Затем ученые отсеквенировали все наличные штаммы вирусов всех трех линий и отыскали еще несколько десятков мимивирусов, доведя общее число прочитанных геномов до 60 штук. По задумке ученых, иммунитет мимивирусов линии А, как и в случае бактериальной CRISPR/Cas, должен был быть связан с наличием в их геноме «досье» фрагментов вирусной ДНК. В случае CRISPR/Cas эти фрагменты (спейсеры) расположены в особом месте генома (между повторяющихся последовательностей) и окружены генами, ответственными за поиск и разрушение паразитической ДНК.
Секвенирование показало, что хотя у мимивирусов нет типичных для CRISPR повторов (иначе они давно были бы найдены), у всех представителей линии А присутствует один короткий фрагмент, полностью идентичный куску генома вирофага замилон. В то же время у мимивирусов других линий эта последовательность (28 нуклеотидов) встречается только в единичном случае. Что еще более важно, 15-нуклеотидная часть этого фрагмента была четырежды повторена в геноме у «устойчивой» первой линии, но таких повторов у нестойчивых линий B и C не было совсем. Таким образом, повторы фрагмента генома потенциального паразита делают мимивирусов устойчивыми к его заражению.
Анализ геномного окружения этих повторов позволил авторам статьи обнаружить несколько белков, родственных тем, что традиционно ассоциированы с CRISPR-повторами у бактерий. Среди них были как разрушеющие ДНК ферменты-экзонуклеазы, так и распутывающие нуклеиновую кислоту геликазы. Интересно, что снижение активности этих генов с помощью РНК-интерференции вело к значительной потере иммунитета — скорость репликации вирофага в клетке, зараженной мимивирусом, возрастала в десятки раз. Ключевыми для иммунитета оказались три из 27 генов-кандидатов, расположенных поблизости от 15-нуклеотидных повторов.
Таким образом, противовирусная система, обнаруженная авторами у мимивирусов, действительно защищает их от вирофагов (по крайней мере одного из них), хотя и устроена существенно иначе, чем бактериальная CRISPR/Cas. Именно поэтому она до сих пор не была найдена теми методами, которые используются сейчас для исследования геномов. Тем не менее, мимивирусная система опирается на тот же принцип: создание архива фрагментов ДНК «потенциального противника» и их целенаправленное уничтожение. Исследование новой противовирусной системы открывает возможность поиска новых направленных нуклеаз по аналогии с теми, что были открыты в ходе изучения системы CRISPR/Cas. Главным недостатком используемой сейчас нуклеазы Cas9 является размер — она очень велика для существующих сейчас вирусных систем доставки в клетки. Использование новой, менее крупной мимивирусной нуклеазы, возможно, поможет решить эту проблему.
Александр Ершов