Урок зельеварения

Акулий жир добавляют в вакцины с 1997 года, потому что он богат скваленом —предшественником стероидов. Особенно много его в печени акулы: у этих рыб нет плавательного пузыря, поэтому плавучесть им обеспечивает жирная печень. Ее масса может достигать четверти массы всего животного, и до половины жировых запасов в ней — как раз сквален.

Медики заинтересовались печенью акулы оттого, что та давно и широко используется в традиционной медицине самых разных народов. Сквален из нее выделили и описали в Японии в начале XX века — а имя он получил в честь семейства акул Squalidae, печень которых особенно им богата. С момента открытия сквалену приписали свойства антиоксиданта, антионкогенные и барьерные свойства. Также он является естественным жировым компонентом здоровой кожи человека: сквален удерживает в ней влагу, поэтому сквалан, гидратированную производную сквалена, добавляют в косметику.

Сотрудники компании Novartis, исследуя свойства сквалена, выяснили, что эмульсия, содержащая сквален и некоторые другие поверхностно активные вещества, не только стабилизирует белковые компоненты вакцин, но и усиливает их иммуногенные свойства — так в 1997 году появилась вакцина от гриппа, где в качестве адъюванта использовался сквален-содержащий компонент MF59. Вскоре на сквален обратили внимание и другие фармацевтические гиганты: например, GSK разработала вакцину от ковида с использованием скваленовой эмульсии, которую в конце 2022 года одобрил европейский регулятор. 

Защитники дикой природы, которые протестовали против скваленовых адъювантов в вакцинах от гриппа, крайне встревожены тем, что GSK и Novartis не стали отступаться от своей формулы и в случае с вакцинами от ковида. В одной дозе вакцины содержится примерно 10 миллиграмм акульей печени, так что каждой акулы должно хватать на 33 000 доз — но на то, чтобы провести кампанию по вакцинации в одной стране, нужны как минимум миллионы, а в среднем десятки миллионов прививок. При том, что по некоторым оценкам еще до пандемии для добычи сквалена вылавливали до шести миллионов акул, причем львиную долю спроса на него — до 90 процентов — обеспечивала индустрия косметики.

За последние 50 лет мировая популяция акул снизилась на 70 процентов. При этом в природе есть и другие источники сквалена — к примеру, им богаты оливковое и амарантовое масла. Ученые работают над синтетическими заменителями сквалена, которые обладали бы аналогичными физическими и иммуногенными свойствами, и предлагают синтезировать его в дрожжах. Но все упирается в стоимость очистки — пока что акулья печень остается самым дешевым источником столь нужного фармкомпаниям вещества.

Мечехвосты, дальние родственники раков и пауков, известны прежде всего как «живые ископаемые». Они появились еще в ордовике, около 450 миллионов лет назад, и до наших дней сохранилось четыре вида — против 70 вымерших. 

В 1950-х годах физиолог Фред Банг, который исследовал циркуляцию крови на модели мечехвоста, выяснил, что серьезная бактериальная инфекция приводит к смерти животного в результате превращения всего объема его «крови» (гемолимфы) в подобие геля. Оказалось, что клетки, присутствующие в гемолимфе мечехвоста (их назвали амебоцитами), содержат гранулы с веществом, вызывающим процесс, который похож на свертывание крови. При встрече с бактериями оно выбрасывается в окружающую среду и вызывает формирование сгустка вокруг патогена, который не позволяет ему размножаться. 

Самое удивительное, что эта реакция происходит, даже если амебоциты разрушены. Это открытие привело к тому, что в 80-е годы появился LAL-тест, который до сих пор остается золотым стандартом для проверки лекарств на бактериальные токсины. 

В мембранах бактерий (в частности, кишечной палочки, которая используется для производства множества рекомбинантных препаратов) содержится эндотоксин, который при попадании в кровь вызывает у млекопитающих острую воспалительную реакцию. Поэтому каждую партию препаратов, которые вводят внутривенно, необходимо проверить на наличие эндотоксинов. В 1983 году американская FDA официально рекомендовала использовать для этого гемолимфу мечехвостов. Ранее для оценки наличия эндотоксина использовали кроликов, которым кололи препарат и смотрели, не повысилась ли у них от этого температура тела.

LAL-тест (сокращение от Limulus amebocyte lysate, то есть лизат амебоцитов мечехвоста) позволяет измерить наличие токсина по формированию геля. Реактивы для него получают, забирая гемолимфу у атлантических мечехвостов, которых после забора отпускают обратно в море. За год через такую процедуру проходят сотни тысяч животных. 

Появление LAL-теста было значительным событием для фарминдустрии. Это позволило сократить процедуру проверки фармпрепаратов с нескольких дней до нескольких минут. А дальнейшие исследования физиологии мечехвостов позволили выделить конкретный белок (фактор С), ответственный за эту реакцию. Этот фактор в настоящее время синтезируют в микроорганизмах и на его основе сделан тест, имитирующий оригинальный LAL-тест. В 2012 году FDA разрешила фармкомпаниям использовать его в качестве альтернативы, тем не менее, не выпустив официальных рекомендаций. Таким образом, благодаря неповоротливости американской бюрократической машины (на решения которой во многом ориентируются и в остальном мире) кровопролитная индустрия на мечехвостах все еще работает в полную мощность.

Эмбриональная сыворотка — это необходимый компонент ростовых сред для выращивания клеток человека вне организма. Как правило в фарминдустрии используется сыворотка крови эмбрионов крупного рогатого скота — это побочный продукт мясной промышленности, так как доля беременных коров на бойнях составляет около восьми процентов.

Любые исследования молекулярных механизмов, например, развития рака, требуют экспериментов с изолированными клеточными линиями. Клетки кожи, соединительной ткани, иммунные клетки, нервные клетки — практически все они обладают своими особенностями, и их можно выращивать в чашках Петри в специальной ростовой среде. Чтобы обеспечить клетки всеми необходимыми компонентами, проще всего добавить в среду сыворотку крови. Лучше всего — эмбриональную, потому что в ней содержится больше всего ростовых факторов и витаминов. Кроме того, там практически нет антител, которые могут блокировать рост клеток.

Впервые для клеточных исследований ее предложил использовать американский исследователь Теодор Пак в 1958 году. Вскоре после этого сыворотку начали использовать не только для культивации клеток человека и других млекопитающих, но и клеток насекомых. Сегодня расход сыворотки любой исследовательской лаборатории, которая изучает млекопитающих, огромен, не говоря уж о фарминдустрии. Ежегодно в мире производится около 800 тысяч литров сыворотки (для чего требуется около двух миллионов нерожденных телят).

Конечно, состав сыворотки уже разобран на запчасти, и нерожденным телятам предлагают искусственные альтернативы. Причем они даже лучше, чем оригинал с бойни: состав эмбриональной сыворотки нестабилен и за клеточные биологи иногда сталкиваются с неприятными сюрпризами, связанными, например, с невоспроизводимостью результатов оригинального эксперимента или неожиданной реакцией изучаемых клеток на компоненты ростовой среды. Точный состав каждой партии сыворотки никто не определяет, поэтому концентрация витаминов или других ростовых факторов от случая к случаю может довольно сильно отличаться. 

Тем не менее, некоторые особо капризные клеточные линии отказываются расти на восстановленной среде, поэтому полностью отказаться от использования сыворотки в биотехнологических исследованиях и производстве не удается. Кроме того, учитывая обороты мясной промышленности, дефицита эмбриональной сыворотки в ближайшее время не предвидится. 

Еще одна хорошая альтернатива телячьей сыворотке — лизат человеческих тромбоцитов, который готовят из просроченной донорской крови. Исследования показывают, что он хорошо воспроизводит ростовые качества сыворотки для некоторых клеточных линий, однако непонятно, сможет ли переход на него удовлетворить потребности рынка.

Коллаген отвечает за прочность и эластичность наших соединительных тканей. Кроме того, что этот белок применяется в качестве пищевой добавки, он также активно используется и в лабораториях для воссоздания межклеточного матрикса в тканевой инженерии и для создания подложек для культивации некоторых клеточных линий. Кроме того, так как коллаген это биосовместимый материал, он используется для создания искусственной кожи, покрытия протезов, в качестве носителя для лекарств, и еще во множестве ипостасей.

Историю его применения в качестве биоматериала отсчитывают с 1881 года, когда из коллагена, выделенного из овечьего сухожилия, хирурги предложили готовить материал для наложения швов. В 1956 году коллаген начали использовать для культивации клеток соединительной ткани in vitro, чтобы точнее имитировать условия формирования тканей в организме. А с 90-х годов его используют при изготовлении костных имплантов. 

Промышленных источников коллагена очень много. Это и различные части крупного рогатого скота, и свиная кожа, и так называемый «морской коллаген» (в данном случае это в основном рыбные отходы и морские беспозвоночные), и даже такие экзотические источники как хвосты кенгуру или утиные лапы. В норме коллаген состоит из высокомолекулярных фибрилл, однако при промышленном выделении белка на выходе получается так называемый гидролизованный коллаген, состоящий из коротких аминокислотных цепочек. Его можно использовать и как для изготовления оболочек для колбасы, так и (в зависимости от степени очистки) в биоинженерных целях. 

Тем не менее, многие свойства коллагена были изучены на белке, выделенном из крысиных хвостов. Из крысиных сухожилий удобно выделять высокомолекулярные комплексы для исследования, к примеру, их физико-химических свойств (способности к растяжению или количеству кросс-сшивок), и влияния разных факторов — таких как возраст или заболевания — на этот параметр.

Кроме того, в отличие от свиной кожи, в лаборатории крысиные хвосты всегда под рукой. Видимо по этой причине один из самых цитируемых протоколов для выделения коллагена предлагает в качестве источника именно их. Он описывает методику выделения коллагена из тридцати хвостов. Впрочем, если вы не хотите выделять крысиный коллаген самостоятельно, на рынке множество производителей, которые сделают это за вас.

Молоки промысловых рыб, в частности, лосося или сельди, используются в биотехнологии как дешевый источник ДНК. Селедочную сперму, например, применяют как в научных экспериментах, так и в промышленности, в качестве сырья для носителей лекарств. 

Например, ДНК в экспериментах используют для трансформации клеток дрожжей, то есть введения в их клетки рекомбинантных молекул ДНК, чтобы получить тот или иной белок. В 80-х годах ХХ века биохимики обнаружили, что использование денатурированной (то есть разделенной на отдельные цепочки) ДНК лосося (ДНК-носителя) увеличивает эффективность попадания молекул в клетки на два порядка. 

Точный механизм этого эффекта неизвестен, но авторы протокола предположили, что целевые молекулы ДНК прилипают к клеточной стенке дрожжей в отсутствие носителя, и оттого вероятность их попадания внутрь клетки снижается. ДНК-носитель насыщает места возможного неспецифического связывания с клеточной стенкой, таким образом, оставляя всю целевую ДНК в растворе, чтобы та могла попасть в клетку. Либо ДНК-носитель отвлекает на себя ферменты, которые разрушают ДНК, таким образом позволяя целевой молекуле ДНК беспрепятственно попасть внутрь клетки. 

Пригодиться сперма лосося может и для гибридизации молекул ДНК на мембране. В этом протоколе специфическая последовательность ДНК (ДНК-зонд) связывается с измельченной геномной ДНК, которую предварительно разделяют на фрагменты при помощи электрического поля и переносят на мембрану. Это нужно, например, чтобы показать исследователям, сколько раз эта последовательность ДНК-зонда встречается в геноме.  ДНК лосося здесь также используется, чтобы занять все возможные неспецифические места связывания на мембране, чтобы ДНК-зонд мог связаться только с геномной ДНК, а не с мембраной.

А два года назад китайские ученые предложили использовать ДНК еще и для создания биопластика, которому можно легко придать форму, намочив его.

Amanita phalloides содержит целых три группы токсинов, разные по механизму действия. На первом месте (самые убийственные) стоят аматоксины, в частности, альфа-аманитин, который устойчив к температуре и высушиванию, отлично всасывается в желудочно-кишечном тракте и приводит к смерти через несколько часов или даже дней после употребления гриба в любом виде. 

Аманитин ингибирует РНК-полимеразу, то есть останавливает считывание генетической информации внутри клеток. Для этой же цели токсин может использоваться и в лаборатории, например, для исследования структурных особенностей полимеразы.

Вторая группа токсинов — фаллотоксины, из которых самым изученным является фаллоидин. Исследуя механизм действия фаллоидина на клетки, ученые выяснили, что он связывается с главным белком клеточного скелета актином, причем только тогда, когда тот находится в форме полимера. В организме млекопитающих токсин поглощается преимущественно клетками печени, и связывание с цитоскелетом вызывает их медленное (в течение нескольких дней) разрушение. Интересно, что в отличие от аманитина, фаллоидин не всасывается в ЖКТ и токсичен только в искусственных условиях, если ввести его в брюшную полость или в вену.

Фаллоидин используют для визуализации цитоскелета внутри клеток. Токсин был выделен из гриба в 30-х годах прошлого века, механизм его действия был описан в 80-х, а использовать его для окрашивания актина начали уже в начале XXI века (статья с методом вышла в 2001 году). Если пришить к нему флуоресцентный краситель, фаллоидин работает даже лучше, чем антитела против актина, так как связывается не с отдельными молекулами, а с актиновыми нитями, что позволяет уменьшить интенсивность фона и четко разглядеть их при помощи флуоресцентного микроскопа. Впрочем, сейчас фаллоидин научились синтезировать химическим путем, и его больше не добывают из поганок.