Запомните эти буквы

Вчера стало известно, что Великобритании разрешат в исследовательских целях редактировать геном эмбрионов человека. Для этого будет использоваться открытая буквально несколько лет назад технология CRISPR/Cas9. Мы попытались ответить на самые очевидные вопросы, которые в связи с этим возникают: что это такое, зачем это нужно и как новая технология изменит медицину.

Что конкретно произошло?

Британское государственное агентство HFEA (Human Fertilisation and Embryology Authority — Управление по эмбриологии и искусственному оплодотворению) разрешило проводить генетическую модификацию человеческих эмбрионов с помощью технологии CRISPR/Cas9. До сих пор подобные исследования в Соединенном Королевстве и на Западе вообще были запрещены. Ранее, около года назад, первые эксперименты были проведены в Китае, но их легальный статус был неясен и они вызвали поток критики со стороны исследователей. Великобритания же станет первой из западных стран, официально разрешивших применение технологии редактирования генома по отношению к человеческим эмбрионам.

Стоит отметить, что разрешение касается только исследовательских целей. Выдано оно пока единственному научному коллективу — группе, возглавляемой Кети Никен (Kathy Niakan) из Института Френсиса Крика. Ученые будут обязаны уничтожить полученные ГМ-эмбрионы в течение 14 дней после их получения. И, конечно, их нельзя будет подсаживать женщине для вынашивания.

И что же тогда в этом сенсационного?

Старт исследований в Великобритании — это важный шаг для начала применения технологии редактирования генома на людях. Потенциально, технология CRISPR/Cas9 способна изменить отношение человечества к сотням и тысячам наследственных заболеваний. Если раньше они были либо полностью неизлечимы, либо допускали паллиативное, симптоматическое лечение, то сейчас открывается возможность их лечить «по-настоящему», то есть устранять саму причину возникновения болезни.

Одновременно с появлением технологии редактирования генома появляется и возможность его «улучшения», в самых разных смыслах. Пока речь идет о довольно простых (с точки зрения механизма наследования) заболеваниях, но потенциально мишенями для редактирования могут стать не только «поломанные» гены, но и гены просто связанные с повышенным риском для здоровья. Или даже гены, отвечающие за безобидные физиологические особенности вроде способности пить молоко во взрослом возрасте или успехи в спорте.

Эта технология позволит лечить рак?

Возможно, но не сразу. То, что называется в обиходе «раком» — это гигантское семейство различных болезней с различными механизмами возникновения. Существуют разновидности рака, вероятность возникновения которых тесно связана с особо «неудачными» вариантами некоторых генов. Типичный пример — ген BRCA1, мутации в котором могут повышать вероятность возникновения рака груди в несколько раз. Потенциально, с помощью технологии CRISPR/Cas9 можно внести изменения в геном сперматозоида или яйцеклетки и таким образом предотвратить передачу мутантного варианта гена своим детям.

Проблема в том, что для большинства онкологических заболеваний наследственность не играет большой роли, а значит, технология редактирования генома будет почти бесполезна. С другой стороны, существуют тяжелые наследственные заболевания, у которых высокая наследуемость, но она настолько сложна и запутана, что не понятно, где и какие нужно вносить изменения в геном, чтобы снизить риск их возникновения. Типичный пример — шизофрения, риск развития которой, как считается, наследуется на 80 процентов (это показано на однояйцевых близнецах). При этом молекулярный механизм наследования шизофрении до самого последнего времени был совершенно непонятен и только сейчас стал проясняться.

Если говорить о том, что с помощью CRISPR/Cas9 можно будет лечить в первую очередь, то это прежде всего простые моногенные заболевания вроде бета-талассемии, муковисцидоза или гемофилии.

Что нового в этой технологии, если методы создания ГМ-животных давно известны?

Получить ГМО можно разными путями, в том числе и с помощью системы CRISPR/Cas9. Сейчас именно на эту технологию переходит все больше и больше бионженеров. Однако между старыми и новыми технологиями есть одно принципиальное отличие: это направленность внесения изменений. Именно в ней заключается принципиальное отличие технологии CRISPR/Cas9.

Раньше, чтобы добиться появления нового нужного свойства у организма биоинженеры просто встраивали ДНК-конструкцию в клетки. При этом место в геноме, куда эта конструкция попадет, предсказать было невозможно (за исключением отдельных случаев вроде пекарских дрожжей). Это приводило к тому, что, во-первых, природная версия гена в геноме сохранялась (если она там, конечно, была) и только дополнялась новой, искусственной версией.

Такой метод подходит для получения какого-то нового свойства, например, усиленной выработки гормона роста у ГМ-лосося или для синтеза витамина А в зернах риса. Однако когда речь идет о замене сломанного гена на его правильную копию, тем более в человеческой ДНК, то понятно, что ненаправленность — это большой минус. Кроме того, случайное встраивание в геном может приводить к неэффективной работе трансгена — активность любого гена у ядерных организмов зависит от его окружения, от локальной структуры хроматина. Поэтому трансген, попавший в неудачный кусок генома, может оказаться просто-напросто выключен или, наоборот, слишком активен. В отличие от старых методов технология CRISPR/Cas9 позволяет не просто встроить новую последовательность в ДНК, а заменить ее старую версию на новую.

И как это работает?

В два этапа. Сначала специальная нуклеаза (т. е. фермент, разрезающий ДНК), вносит двуцепочечный разрыв в нужное место генома. Это место нуклеаза находит с помощью короткой направляющей РНК (подобранной учеными), чья последовательность должна с точностью до буквы совпадать с нужной последовательностью в геноме. После того, как разрыв внесен, включаются внутренние механизмы клетки, так называемая система репарации.

Нужно понимать, что появление двуцепочечного разрыва в ДНК — это аварийная ситуация для любой клетки. Разрыв ведет к появлению мутаций и вообще угрожает целостности генома. Поэтому существуют специальные белки, которые находят «оборванные концы» в геноме и запускают реакцию «починки». Разрыв, конечно, может быть просто склеен обратно, но это чревато потерей нескольких «букв» на месте стыка и, как следствие, сдвигом рамки считывания и полным выключением гена. Поэтому клетка обычно предпочитает найти похожую последовательность поблизости в геноме и использовать ее в качестве образца для восстановления правильной последовательности в месте разрыва. Вот тут-то ферментам можно подсунуть тот вариант ДНК, которым мы хотим заменить природную последовательность.

Система гомологичной рекомбинации известна с 70-х годов прошлого века, что нового привнесла технология CRISPR/Cas9?

Метод редактирования генома CRISPR/Cas9, по крайней мере в той форме, что существует сейчас, никак не затрагивает природный механизм рекомбинации — после того, как разрыв внесен, замена ДНК происходит за счет природных механизмов.

Сложность с редактированием генома до сих пор заключалась именно в том, чтобы внести этот разрыв. Он должен появится в одном-единственном месте генома и нигде больше — именно потому, что такие разрывы ведут к появлению мутаций. Для сравнения, размер генома человека составляет около трех миллиардов нуклеотидов, а направляющая последовательность РНК, которая должна найти в геноме свое место посадки, имеет в длину около двадцати-сорока нуклеотидов. Удивительно, что ей вообще это удается. Если же речь идет не об отдельной клетке, а о генной терапии целой ткани, то задача становится еще сложнее — все клетки должны быть модифицированы, но каждая только по одному разу.

До открытия системы CRISPR/Cas9 ученые уже пытались разработать методы внесения направленных разрывов в ДНК. Например, большую работу в этом направлении проделал наш бывший соотечественник Федор Урнов. Речь идет о рациональном дизайне белков-нуклеаз, которые бы самостоятельно (без направляющей РНК) находили уникальные последовательности в геноме. Сложность с этими методами в том, что они требуют разработки под каждую конкретную задачу своего собственного белка, который затем нужно синтезировать, выделить, протестировать и т. д. Работать с универсальной нуклеазой и специфической направляющей РНК гораздо проще, но ученые не знали о такой возможности, пока не была открыта система бактериального иммунитета.

И при чем здесь бактерии?

За технологией CRISPR/Cas9, которую мы рассматриваем просто как способ редактирования генома, стоит фундаментальное и очень важное для современной биологии открытие. Оно заключается в том, что огромное число бактерий несут в своем геноме (где, казалось бы, все давным-давно понятно) изящную систему адаптивного иммунитета против вирусов. Основа этой системы это особые участки генома — короткие палиндромные кластерные повторы или CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats). 

Повторы выступают в роли «полок», между которыми в геноме расположены «досье» на вирусы, с которыми когда-то сталкивались предки данной бактерии. «Досье» — это просто короткие фрагменты ДНК, которые совпадают по последовательности с фрагментами генома ДНК вирусов. Если вирус с совпадающей ДНК попадет в бактериальную клетку, он довольно быстро будет распознан специальным ферментом, нуклеазой Cas9. Последний для поиска вирусной ДНК использует синтезированную с CRISPR РНК-копию. 

Если какой-либо фрагмент генома вируса точно совпал с тем, что записано в «досье», Cas9 разрезает вирусную ДНК и запускает цепь реакций, в результате которой вся она уничтожается. В общих чертах эта схема напоминает РНК-интерференцию, которая была открыта у ядерных организмов лет на десять раньше, но это (как и всё у эукариот) существенно более сложная и менее эффективная система.

Ближе к практике. Когда с помощью CRISPR/Cas9 будут лечить?

Уже лечат, хотя пока только лабораторных животных. В начале этого года появились обнадеживающие данные по лечению миодистрофии Дюшена у взрослых мышей, причем эксперименты были проведены в трех различных лабораториях независимо. Буквально на днях стало известно об успешном применении технологии для лечении тяжелого пигментного ретинита.

Стартап Editas Medicine, тесно связанный с первооткрывателями технологии, уже привлек более 120 миллионов долларов инвестиций (в том числе от Google). Эти деньги пойдут на создание экспериментального лечения амавроза Лебера десятого типа — это наследственная слепота, связанная с повреждением одного из генов, необходимых для работы светочувствительных клеток сетчатки. Клинические (то есть на людях) испытания в Editas Medicine обещают начать уже в следующем году.

Почему же китайская работа с эмбрионами вызвала скандал и зачем британцы разрешили работу только в исследовательских целях? В чем проблема?

Проблема в долгосрочных последствиях процедуры редактирования генома, которые сейчас сложно предсказать. Это звучит как бессмысленный алармизм, обычно исходящий из уст противников ГМО, но на самом деле здесь ситуация принципиально иная.

Эффективность редактирования с помощью CRISPR/Cas9 пока недостаточна для того, чтобы говорить о «точном как скальпель» исправлении генома — что бы там не писали авторы популярных изданий. Одновременно с нужным разрывом в геном часто вносятся и лишние, а это, как уже говорилось, провоцирует мутации. Даже если разрыв внесен правильно, эффективность гомологичной рекомбинации, за счет которой происходит замена исходной последовательности на нужную, очень далека от 100 процентов.

Какова реальная эффективность — вопрос более сложный, чем кажется, ведь она сильно зависит от типа и природы клеток, в которых проводится редактирование. То, что хорошо работает на мышах, может плохо работать на людях. И пока исследователи не станут работать с реальными человеческими эмбрионами и яйцеклетками об эффективности процедуры и уровне случайных разрывов можно будет только догадываться.

На сегодняшний день есть результаты только одного эксперимента с редактированием генома в человеческом эмбрионе — те самые, что были опубликованы китайской группой в апреле прошлого года (и отвергнуты Science и Nature по этическим основаниям). Тогда ученые работали с 86 оплодотворенными яйцеклетками, из которых 71 выжила и 54 были отобраны на анализ. В 28 из 54 клеток фермент Cas9 внес нужные разрывы в геном, но только в четырех случаях репарация разрыва завершилась заменой последовательности гена на нужную. Одновременно с этим ученые обнаружили в геноме клеток множественные разрывы там, где их не должно быть.

Такая низкая эффективность и высокий уровень ошибок оказались сюрпризом для самих авторов работы, о чем они честно признаются в статье. С чем эта низкая эффективность связана — с «кривыми» руками ученых или с особенностями человеческих эмбрионов, — будет непонятно до тех пор, пока эксперименты не будут многократно повторены другими группами. До сегодняшнего дня, когда Великобритания, наконец, разрешила их проводить, такой возможности у западных исследователей не было.

И что теперь будет?

Будем надеяться, что технологию удастся довести до приемлемого уровня точности и эффективности. Многое в этом направлении было сделано уже после публикации китайской работы. Например, в декабре прошлого года ученым удалось создать искусственную версию фермента Cas9, которая во много раз точнее природной и почти не вносит лишних разрывов в геном.

Эффективность замены последовательности повысить будет сложнее, так как она целиком полагается на природные механизмы гомологичной рекомбинации, но работа в этом направлении ведется. Однако даже если эффективность останется низкой, при отсутствии побочных эффектов технологию CRISPR/Cas9 все же можно будет применить для внесения наследуемых изменений в зародышевую линию человека. Например, можно взять у пациента клетки соединительной ткани, провести редактирование генома и отобрать только те из них, где редактирование прошло без осложнений. Эти клетки можно использовать для получения индуцированных стволовых клеток, из которых можно затем получить сперматозоиды и использовать их в ЭКО. Здесь возникают свои сложности, но по крайней мере на животных эта технология работает.

Но не все так радужно на CRISPR-горизонте. Чем ближе реальное клиническое применение технологии, тем сильнее разгорается спор о том, кто получит от нее доход. По некоторым оценкам, стоимость исключительного патента на технологию может достигать многих сотен миллионов долларов (по крайней мере в таких суммах измеряется объем венчурного финансирования CRISPR/Cas9-стартапов). Патентный спор вокруг CRISPR/Cas9 обещает быть громче, чем все, что когда-либо происходило в сфере интеллектуальной собственности на биотехнологии.

11 января этого года Ведомство по патентам и товарным знакам США (USPTO) начало процедуру проверки патентов, относящихся к CRISPR/Cas9, на предмет «интерференции». Чиновникам предстоит определить, какой из исследовательских групп, владеющих схожими патентами, следует отдать приоритет в создании технологии: в ход пойдут публикации, свидетельские показания, почтовая переписка и записи в лабораторных журналах. От исхода процесса будет зависеть будущее всей технологии, ведь законные владельцы смогут просто запретить использование своей технологии компаниями-конкурентами, а это, в конечном итоге, поставит крест на надеждах быстрого внедрения CRISPR/Cas9 в клинику.

Ученые, которые поначалу совместно пытались довести технологию до ума, разделились как минимум на два оппозиционных лагеря, каждый из которых претендует на приоритет открытия. С одной стороны, это Дженифер Дудна, которая совместно с Эммануэль Шарпетье опубликовала ключевую работу по практическому применению Cas9 при модификации генома. Вышла эта статья в конце 2012 года.  Весной следующего года Дудна подала патент на эту технологию, но в том же году появилось множество сходных работ от других исследователей, которые пытались по-своему усовершенствовать метод. Один из них, Фен Женг (Feng Zhang) из Института Броуда подал собственный патент на CRISPR/Cas9 в октябре того же 2013. И хотя это произошло уже после подачи патента Дудны, патент Женг прошел по упрощенной процедуре и был выдан первым.

Сейчас в патентном споре в ход пошла крупная артиллерия: Эрик Лендер, профессор MIT и один из со-председателей Комитета по науке и технологиям при президенте США, на днях опубликовал в Cell статью «Герои CRISPR», в которой излагает свой взгляд на то, кто во всей этой истории внес наибольший вклад и почему. Чем вызван порыв Лендера разобраться в этом вопросе именно сейчас — желанием повлиять на патентное бюро или чисто академическим интересом, — не понятно. Вполне ожидаемо, однако, что он (как основатель Института Броуда, от которого Женг подавал свой патент), придает вкладу Дудны и Шарпентье не такое большое значение, как хотелось бы последним. Ясно, что Дудна и Шарпеньтье, каким бы большим ни был академический и аппаратный вес Лендера, не сдадутся без боя. Достаточно посмотреть на их комментарии к злополучной статье, которые они уже оставили в Pubmed. Их можно понять, ведь дело не только и не столько в злополучном патенте. Речь, безусловно, идет о том, кому достанется ближайшая нобелевская премия.

Александр Ершов