Репрограммирование вернуло остроту зрения пожилым и травмированным мышам

Поврежденные глаукомой нейроны сетчатки впервые заставили регенерировать. Этого результата добились американские биологи с помощью технологии частичного репрограммирования: они ввели в глаза мышей вирусные векторы с генами факторов Яманаки, которые не перевели нейроны в зародышевое состояние, но восстановили их работоспособность. То же самое удалось провернуть и со стареющими животными — факторы Яманаки вернули им прежнюю остроту зрения. Это исследование опубликовано в журнале Nature. Судя по всему, за омолаживающий эффект здесь отвечает деметилирование: под действием факторов Яманаки в клетках восстанавливается «молодой» набор эпигенетических меток на ДНК. А вот каким образом клетка «помнит» о том, какой набор меток соответствует ее молодости — пока совершенно неясно.

Один из способов отличить старые клетки от молодых — посмотреть на набор эпигенетических маркеров, то есть метильных меток на ДНК и гистоновых белках, на которые эта ДНК накручена. С течением времени одни гены приобретают эти метки, а другие теряют. Таким образом в клетке меняется комплект генов, которые доступны для считывания информации, и из-за этого стареющая клетка теряет разные свойства, присущие молодой — например, способность делиться, превращаться в другие клеточные типы или избавляться от молекулярного мусора. Поэтому набор меток на ДНК — так называемые «эпигенетические часы» — можно использовать, чтобы измерить биологический возраст человека.

До сих пор нет работающих методов его снижения (если не считать одного случая, когда участники клинического испытания, нацеленного на восстановление функции тимуса, за год исследования стали на два года моложе эпигенетически), зато можно «обнулить» эпигенетический возраст для отдельных клеток. Этого можно добиться с помощью технологии репрограммирования, за которую в 2012 получил Нобелевскую премию Синъя Яманака. Суть ее в том, что в клетки вводят четыре фактора транскрипции (факторы Яманаки), которые превращают их из дифференцированных в стволовые, аналогичные клеткам на ранних стадиях эмбриогенеза — и эпигенетический возраст тоже начинает соответствовать зародышевому состоянию.

Применить эту технологию к целому организму гораздо сложнее. Во-первых, для того, чтобы омолодить организм, не нужно превращать его клетки в зародышевые. Это было бы даже вредно — из них могут вырасти опухоли, а свои функции они при этом выполнять перестанут. Эту проблему могло бы решить частичное репрограммирование — например, когда факторы транскрипции вводят в клетки на короткое время.

Вторая трудность состоит в том, чтобы подействовать на все клетки организма одновременно. Этого результата удалось добиться на преждевременно стареющих мышах, которым с помощью репрограммирования продлили жизнь на 30 процентов. Но для этого мышей пришлось генетически модифицировать — то есть встроить гены факторов Яманаки в геном мышей, чтобы можно было запускать их работу по сигналу извне.

С людьми эта технология едва ли сработает — по крайней мере, пока генетически их модифицировать запрещено. Поэтому группа ученых из Гарвардской медицинской школы, в состав которой вошли известные биологи Вадим Гладышев (Vadim Gladyshev) и Джордж Черч (George Church), геронтолог Дэвид Синклер (David Sinclair) и разработчики эпигенетических часов Морган Левин (Morgan Levine) и Стив Хорват (Steve Horvath), решила попробовать другую методику.

Исследователи создали аденовирусный вектор, который должен был доставить в клетки мышей гены трех факторов Яманаки (четвертый, как наиболее онкогенный, было решено исключить). Это позволяет не модифицировать организм целиком, а ввести гены в отдельные исследуемые клетки. При этом все три гена находились под контролем промотора, который запускается только под действием препарата доксициклина. Таким образом авторы работы получили возможность запускать и тормозить работу факторов Яманаки извне — просто добавляя животным доксициклин в питьевую воду.

Для начала исследователи проверили, что эта методика безопасна: они вводили свой вектор и молодым (5 месяцев) и пожилым (20 месяцев) мышам и время от времени активировали работу факторов Яманаки, но не заметили отличий от контрольных животных ни в состоянии здоровья, ни в количестве опухолей.

Затем авторы работы решили протестировать свою методику омоложения клеток на ганглионарных клетках сетчатки. Это нейроны, по отросткам которых нервные импульсы от глаза поступают в мозг. Они примечательны тем, что способны регенерировать и отращивать новые аксоны у зародышей и новорожденных, но теряют это свойство с возрастом — и поэтому повреждение зрительного нерва, например, при глаукоме необратимо.

Мышам сначала впрыскивали внутрь глаза вирусные векторы и запускали работу факторов Яманаки доксициклином, потом повреждали зрительный нерв, а затем вводили красители, которые помечали растущие аксоны. Оказалось, что под действием факторов Яманаки количество регенерирующих аксонов увеличивается почти в 5 раз — но только тогда, когда вектор содержал все три фактора. По одиночке они оказывали гораздо более слабый эффект. Причем запустить регенерацию удалось как у молодых (1 и 3 месяца), так и у пожилых (12 месяцев) мышей. Похожие результаты авторы работы получили и на человеческих нейронах — правда, только in vitro.

После этого исследователи проверили, можно ли таким образом восстановить зрение в поврежденном глазу у мышей. Им вводили микрогранулы в переднюю камеру глаза, чтобы повысить давление и вызвать глаукому. После этого в стекловидное тело впрыскивали аденовирусные векторы с факторами Яманаки и на 4 недели запускали их работу доксициклином, а затем измеряли остроту зрения мышей. За месяц лечения репрограммированием исследователям удалось «отыграть» около половины потери остроты зрения у мышей — и, кажется, это первый пример восстановления зрения после травмы нерва при глаукоме.

Наконец, они проверили эту же методику и на стареющих (11 месяцев) мышах, у которых острота зрения снижается даже в отсутствие глаукомы. Оказалось, что и у них введение факторов Яманаки позволяет улучшить зрение — причем настолько, что оно становится неотличимо (p = 0,814) от зрения молодых (3 месяца) мышей. А это уже означает, что репрограммирование можно использовать для того, чтобы обратить возрастные изменения, даже не связанные с конкретной болезнью. И теоретически эта методика могла бы сработать и у людей — поскольку глаз отделен от основного кровотока прочными барьерами, и аденовирусные векторы, введенные внутрь глаза, могут не попасть в остальные органы (поэтому именно в глазу человека впервые попробовали имплантацию репрограммированных клеток, а также генетическое редактирование in vivo).

Затем авторы работы решили выяснить, как в ходе этих процессов изменяется метилирование ДНК. Измерив эпигенетический возраст нейронов по набору меток на рибосомальных генах, они заметили, что травма зрительного нерва повышает возраст клеток, а работа факторов Яманаки, напротив, его снижает. При этом когда в нейронах заблокировали работу деметилаз — белков, которые снимают метки с ДНК — регенерировать они не смогли. Значит, для того, чтобы вернуть нервным клеткам способность отращивать аксоны, необходимо снизить их эпигенетический возраст.

Однако в эксперименте со стареющими здоровыми мышами никакой травмы глаза не было, и нервные клетки не нуждались в новых отростках. Значит, там факторы Яманаки и деметилирование смогли изменить что-то в самой физиологии клеток и вернуть им прежнюю работоспособность. И действительно, исследователи подсчитали, что в стареющих ганглионарных клетках изменяется экспрессия 464 генов, и 90 процентов из них возвращаются на «молодой» уровень после введения факторов Яманаки.

Таким образом, оказалось, что репрограммирование клеток может каким-то образом вернуть их в молодое состояние, не превращая их в стволовые. При этом они не теряют прежних функций и работоспособности, но «перезагружают» свои эпигенетические метки на ДНК. Но коль скоро клетка может вернуться к «молодому» эпигенетическому состоянию, это означает, что оно где-то должно быть «записано». Авторы работы отмечают, что у них нет ответа на этот вопрос, а есть лишь предположения — что это «исходное состояние» может как-то кодироваться другими модификациями ДНК, изменениями хроматина или ДНК-связывающими белками. Но если его удастся так или иначе обнаружить и декодировать, то возможно, мы научимся снижать эпигенетический возраст и в других тканях и органах, а не только в отдельно взятых нейронах глаза.

Технологии репрограммирования еще только начинают свой путь в клинику. На людях их применяют нечасто, хотя известны отдельные случаи, когда пациентам пересаживали роговицу из репрограммированных клеток или даже предшественники нейронов — чтобы затормозить болезнь Паркинсона. А с мышами ученые вовсю экспериментируют in vivo: например, недавно удалось превратить клетки нейроглии в полноценные нейроны, а селезенку — в работоспособную печень.

Полина Лосева